Технологии получения комбинированных липосомальных препаратов доксорубицина тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.23, кандидат химических наук Безруков, Денис Алексеевич

• Безруков, Денис Алексеевич
• кандидат химических наук
• 2007

Оглавление диссертации кандидат химических наук Безруков, Денис Алексеевич

1. Список сокращений.

2. Введение.

3. Обзор литературы.

Липосомы, как средство доставки лекарственных препаратов.

3.1. Свойства мембраны.

3.2. Получение липосом и основные способы загрузки веществ.

3.3. Классические липосомы.

3.4. Стерически стабилизированные или Stealth-липосомы.

3.5. Активно нацеленные липосомы.

3.5.1. Липосомы, нацеленные с помощью антител.

3.5.2. Липосомы, нацеленные с помощью других лигандов.

3.6. Липосомы с контролируемым высвобождением.

3.6.1. Термочувствительные липосомы.

3.6.2. рН-Чувствительные липосомы.

3.7. Активная загрузка липосом.

3.7.1. Загрузка липосом с помощью рН-градиента.

3.7.2. Вторичный рН-градиент.

3.7.3. Загрузка липосом с помощью градиента сульфата аммония.

4. Результаты работы и их обсуждение.

4.1. Оптимизация полупромышленного метода получения стерически стабилизированных термочувствительных активно загруженных доксорубицином липосом.

4.1.1. Выбор метода получения первичной дисперсии мультиламеллярных липосом с сульфатом аммония.

4.1.2. Формирование дисперсии одноламеллярных липосом с сульфатом аммония

4.1.3. Создание градиента концентрации сульфата аммония.

4.1.4. Состав буферного раствора для проведения загрузки липосом доксорубицином

4.1.5. Температурный режим загрузки.

4.1.6. Оценка высвобождения доксорубицина.

4.1.7. Биологические испытания полученной дисперсии.

4.2. Создание и отработка методики получения стерически стабилизированных липосомальных препаратов доксорубицина с возможностью иммобилизации химерных белков с доменом барназы.

4.3. Оценка эффективности комбинированной терапии опухолей при одновременном использовании липосомальных препаратов с различными действующими началами

4.4. Влияние мочевины на стабильность липосомальной дисперсии.

4.4.1. Флуоресцентные исследования.

4.4.2. Оценка микровязкости липосомального бислоя.

4.4.3. Влияние мочевины на активную загрузку липосом доксорубицином при использовании градиента сульфата аммония.

5. Экспериментальная часть.

5.1. Материалы и методы.

5.2. Оптимизация полупромышленного метода получения стерически стабилизированных термочувствительных активно загруженных доксорубицином липосом.

5.2.1. Получение липосом.

5.2.2. Определение степени загрузки доксорубицина.

5.2.3. Определение размера липосом.

5.2.4. Оценка термочувствительных свойств полученных липосом.

5.2.5. Определение степени высвобождения доксорубицина из липосом при 43°С.

5.2.6. Биологические испытания.

5.3. Создание и отработка методики получения стерически стабилизированных липосомальных препаратов доксорубицина с возможностью иммобилизации химерных белков с доменом| барназы.

5.3.1. Контрольный эксперимент.

5.3.2. Электрофорез.

5.3.3. Получение электронных микрофотографий.

5.4. Оценка эффективности комбинированной терапии опухолей при одновременном использовании липосомальных препаратов с различными действующими началами

5.4.1. Получение липосом с доксорубицином.

5.4.2. Получение липосом с ангиостатином.

5.4.3. Определение эффективности загрузки.

5.4.4. Схема эксперимента in vivo.

5.5. Влияние мочевины на стабильность липосомальной дисперсии.

5.5.1. Оценка микровязкости липосомального бислоя.

5.5.2. Влияние мочевины на активную загрузку липосом доксорубицином при использовании градиента сульфата аммония.

6. Выводы.

7. Благодарности.

8. Литература.

1. Список сокращений

АС - ангиостатин АХ - амидхлорин ГТ - гипертермия

ЛПВП - липопротеин высокой плотности ЛПНП - липопротеин низкой плотности ЛПОНП - липопротеин очень низкой плотности Лс - липосомы

МАТ - моноклональные антитела

МФФА - метилфеофорбид А

ОРО - относительный размер опухоли

ТГФ - тетрагидрофуран

ТЛ - термочувствительные липосомы

УСПЖ - увеличение средней продолжительности жизни экспериментальных животных

ФДТ - фотодинамическая терапия

ФС - фотосенсибилизатор

ФФнА - феофитин А

ФХ - фосфатидилхолин

ФС - гидрофильный фотосенсибилизатор

Bs - барстар

BSA - бычий сывороточный альбумин Chol - холестерин

DMPC - димиристоилфосфатидилхолин DOPC - диолеоилфосфатидилхолин DOPE - диолеоилфосфатидилэтаноламин DOX - доксорубицин DPPC - дипальмитоилфосфатидилхолин DSPC - дистеароилфосфатидилхолин DSPE - дистеароилфосфатидилэтаноламин ePC - яичный фосфатидилхолин

HBS (HEPES-buffered saline) - физиологический раствор, забуференный HEPES МАА - метакриловая кислота Mal - малеимид

МРРС - монопальмитоилфосфатидилхолин

NIP AM - N-изопропилакриламид

PEG - полиэтиленгликоль.

РОРС - пальмитоилолеоилфосфатидилхолин sPC - соевый фосфатидилхолин

Заключение диссертации по теме «Биотехнология», Безруков, Денис Алексеевич

6. Выводы

1. Разработана схема полупромышленного получения стерически стабилизированных термочувствительных липосом, загружаемых доксорубицином против градиента сульфата аммония с эффективностью не менее 85% при массовом соотношении субстанция/липиды 0.2.

2. Разработана методика, позволяющая получать стерически стабилизированный липосомальный препарат с эффективностью загрузки доксорубицина 98% при массовом соотношении субстанция/липиды 0.06 и возможностью иммобилизации на поверхности липосом в произвольном соотношении различных химерных белков, содержащих домен барназы.

3. Показано, что мочевина в концентрациях, не превышающих изотоническую, повышает агрегационную устойчивость липосомальных дисперсий различного состава, а также может быть использована в качестве криопротектора.

4. Получен комбинированный липосомальный противоопухолевый препарат. Продемонстрирована эффективность совместного применения липосомальных препаратов с различными действующими началами: цитотоксическим (доксорубицином) и антиангиогенным (ангиостатином) при терапии опухолей.

7. Благодарности

За помощь в работе и плодотворное сотрудничество автор благодарит:

Всех сотрудников, аспирантов и студентов кафедры биотехнологии МИТХТ им. М. В. Ломоносова, принимавших участие в работе, и, за неоценимую помощь, лично

Королеву А. И. и Красильникову В. В.

Д. б. н. В. И. Попенко (ИМБ РАН им. В. А. Энгельгардта).

Всех сотрудников лаборатории разработки лекарственных форм НИИ ЭДиТО РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН и лично руководителя лаборатории д. ф. н., проф. Н. А. Оборотову, а также директора НИИ ЭДиТО д. м. н., проф. А. Ю. Барышникова. Д. б. н., проф. А. А. Вайнсона (НИИ ЭДиТО РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН)

Д. б. н., проф. С. В. Луценко (Московский НИИ медицинской экологии) и всех его сотрудников, принимавших участие в совместной работе.

Д, б. н., проф. С. М. Деева и Т. Г. Баландина (ИБХ им. Ю. А. Овчинникова и М. М. Шемякина РАН)

Фирму «Биолек» (Харьков, Украина)

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Безруков, Денис Алексеевич, 2007 год

1. J. Wells, A. Sen, S.W. Hui. Localized delivery to CT-26 tumors in mice using thermosensitive liposomes // 1.t. J. Pharm. V. 261 (2003) P. 105-114.

2. M. H. Gaber, K. Hong, S.K. Huang, D. Papahadjopoulos. Thermosensitive Sterically Stabilized Liposomes: Formulation and in vitro Studies on Mechanism of Doxorubicin Release by Bovine Serum and Human Plasma // Pharm. Res. V. 12 (1995) No. 10, P. 14071416.

3. J.M. Kim, D.H. Thompson. Acid and Oxidatively Labile Vinyl Ether Surfactants: Syntesis and Drug Delivery Applications // Marcel Dekker, New York, Basel, 2001, P. 145-154.

4. D. C. Drummond, M. Zignani, J.-C. Lerox. Current status of pH-sensitive liposomes in drug delivery// Progr. Lip. Res. V. 39 (2000) P. 409-460.

5. J. M. Sual, A. Annapragada, J.V. Natarajan, R.V. Bellamkonda. Controlled targeting of liposomal doxorubicin via folate receptor in vitro // J. Control. Rel. V. 92 (2003) P. 49-67.

6. Г.М. Сорокоумова, A.A. Селищева, А.П. Каплун. Фосфолипиды. Методы их выделения, обнаружения и изучения физико-химических свойств липидных дисперсий в воде // Москва, МИТХТ, 2000,100 с.

7. G. Haran, R. Cohen, L.K. Bar, Y. Barenholz. Transmembrane ammonium sulfate gradients in liposome produce efficient and stable entrapment of amphipatic weak basis // Biochim. Biophys. Acta V. 1151 (1993) P. 201-215.

8. T. Ishida, Y. Takanashi, H. Doi, I. Yamamoto, H. Kiwada. Encapsulation of an antivasopastic drug, fasudil, into liposomes, and in vitro stability of the fasudil-loaded liposomes // Int. J. Pharm. V. 232 (2002) P. 59-67.

9. S.H. Hwang, Y. Maintani, K. Takayama, T. Nagai. High entrapment of insulin and bovine serum albumin into neutral and positively-charged liposomes by the remote loading method // Chem. Pharm. Bull. (Tokio) V. 48 (2000) No 3, P. 325-329.

10. M. Ceruti, P. Crosasso, P. Brusa, S. Arpicco, F. Dosio, L. Cattel. Preparation, characterization, cytotoxicity and pharmacokinetics of liposomes containing water-soluble prodrugs of paclitaxel // J. Control. Rel. V. 7 (2000) No. 12, P. 1027-1033.

11. M.A. Schubert, C.C. Muller-Goymann. Solvent injection as a new approach for manufacturing lipid nanoparticles evaluation of the method and process parameters // Eur. J. Pharm. Biopharm. V. 55 (2003) P. 125-131.

12. K.-H. Song, S.-J. Chung, C.-K. Shim. Preparation and evaluation of proliposomes containing salmon calcitonin // J. Cont. Rel. V. 84 (2002) P. 27-37.

13. W. Junping, J. Maitani, K. Takayama, T. Nagai. In vivo evaluation of doxorubicin carried with long circulating and remote loading proliposome // Int. J. Pharm. V. 203 (2000) P. 6169.

14. L. Frederiksen, K. Anton, P. van Hoogevest, H.R. Keller, H. Leuenberger. Preparation of liposomes encapsulating water-soluble compounds using sypercritical carbon dioxide // J. Pharm. Sci. V. 86 (1997) N. 8, P. 921-928.

15. S. Vemuri, C.T. Rhodes. Preparation and characterization of liposomes as therapeutic delivery systems: a review // Pharm. Acta Helv. V. 70 (1995) P. 95-111.

16. F. Jiang, L. Lilge, J. Grenier, Y. Li, M.D. Wilson, M. Chopp. Photodynamic therapy of U87 glioma in nude rat using liposome-delivered photofrin // Lasers Surg. Med. V. 22 (1998) P. 74-80.

17. F. Jiang, L. Lilge, B. Logie, Y. Li, M. Chopp. Photodynamic therapy of 9L gliosarcoma with liposome-delivered photofrin // Photochem. Photobiol. V. 65 (1997) P. 701-706.

18. L. Lilge, B.C. Wilson. Photodynamic therapy of intracranial tissues: a preclinical comparative study of four different photosensitizers // J. Clin. Laser Med. Surg. V. 16 (1998) P. 81-91.

19. J.P. Keene, D. Kessel, E.J. Land, R.W. Redmond, T.G. Truscott. Direct detection of singlet oxygen sensitized by haematoporphyrin and related compounds // Photochem. Photobiol. V. 43 (1986) P. 117-120.

20. X. Damoiseau, H.J. Schuitmaker, J.W, Lagerberg, M. Hoebeke. Increase of the photosensitizing efficiency of the Bacteriochlorin a by liposome-delivered incorporation // J. Photochem. Photobiol., B Biol. V. 60 (2001) P. 50-60.

21. D.D. Lasic, F.J. Martin, A. Gabizon, S.K. Huang, D. Papahadjopoulos. Sterically stabilized liposomes: a hypothesis on the molecular origin of the extended circulation times // Biochim. Biophys. Acta V. 1070 (1991) P. 187-192.

22. A.J. Schroit, J. Madsen, R. Nayar. Liposome cell interactions: in vitro discrimination of uptake mechanism and in vivo targeting strategies to mononuclear phagocytes // Chem. Phys. Lipids V. 40 (1986) P. 373-393.

23. P.C. Rensen, W.G. Love, P.W. Taylor. In vitro interaction of zinc (II) phthalocyanine-containing liposomes and plasma lipoproteins // J. Photochem. Photobiol. V. 26 (1994) P. 29-35.

24. C. Milanesi, C. Zhou, R. Biolo, G. Jori. Zn (II)- phthalocyanine as a photodynamic agent for tumours: II. Studies on the mechanism of photosensitised tumour necrosis // Br. J. Cancer V. 61 (1990) P. 846-850.

25. V. Cuomo, G. Jori, B. Rihter, M.E. Kenney, M.A. Rodgers. Liposome-delivered Si (IV)-naphthalocyanine as a photodynamic sensitiser for experimental tumours: pharmacokinetic and phototherapeutic studies // Br. J. Cancer V. 62 (1990) P. 966-970.

26. R.Z. Renno, J.W. Miller. Photosensitizer delivery for photodynamic therapy of choroidal neovascularization // Adv. Drug Deliv. Rev. V. 52 (2001) P. 63-78.

27. C. Milanesi, F. Sorgato, G. Jori. Photokinetic and ultrastructural studies on porphyrin photosensitization of HeLa cells // Int. J. Radiat. Biol. V. 55 (1989) P. 59-69.

28. F. Ricchelli, S. Gobbo, G. Jori, G. Moreno, F. Vinzens, C. Salet. Photosensitization of mitochondria by liposome-bound porphyrins // Photochem. Photobiol. V. 58 (1993) P. 5358.

29. F. Ricchelli, P. Nikolov, S. Gobbo, G. Jori, G. Moreno, C. Salet. Interaction of phthalocyanines with lipid membranes: a spectroscopic and functional study on isolated rat liver mitochondria // Biochim. Biophys. Acta V. 1196 (1994) P. 165-171.

30. J.N. Moreira, R. Gaspar, T.M. Allen. Targeting Stealth liposomes in a murine model of human small cell lung carcinoma // Biochim. Biophys. Acta V. 1515 (2001) P. 167-176.

31. H. Takeuchi, H. Kojima, H. Yamamoto, Y. Kawashima. Passive targeting of doxorubicin with polymer coated liposomes in tumor bearing rats // Biol. Pharm. Bull. V. 24 (2001) P.795-799.

32. D. Needham, T.J. Mcintosh, D.D. Lasic. Repulsive interactions and mechanical stability of polymer-grafted lipid membranes // Biochim. Biophys. Acta V. 1108 (1992) P. 40-48.

33. G.E. Francis, C. Delgado, D. Fisher, F. Malik, A.K. Agrawal. Polyethylene glycol modification: relevance of improved methodology to tumour targeting // J. Drug Target. V. 3 (1996) P. 321-340.

34. N. Oku, N. Saito, Y. Namba, H. Tsukada, D. Dolphin, S. Okada. Application of long-circulating liposomes to cancer photodynamic therapy // Biol. Pharm. Bull. V. 20 (1997) P.670-673.

35. N. Oku, Y. Namba, S. Okada. Tumor accumulation of novel RES-avoiding liposomes // Biochim. Biophys. Acta V. 1126 (1992) P. 255-260.

36. A. Gijsens, A. Derycke, L. Missiaen, D. De Vos, J. Huwyler, A. Eberle, P. de Witte. Targeting of the photocytotoxic compound AlPcS4 to HeLa cells by transferrin conjugated PEG-liposomes // Int. J. Cancer V. 101 (2002) P. 78-85.

37. T.M. Allen. Long-circulating (sterically stabilized) liposomes for targeted drug delivery // TIPS V. 15 (1994) P. 215-220.

38. T.M. Allen, C.B. Hansen, D.D. Stuart. Targeted sterically stabilized liposomal drug delivery // P. Lasic (Ed.), Medical Applications of Liposomes, Elsevier, Amsterdam (1998) P. 297323.

39. T.M. Allen, D. Lopes de Menezes, C.B. Hansen, E.H. Moase. Stealth liposomes for the targeting of drugs in cancer therapy // McC. Gregoriadis (Ed.), Targeting of Drugs 6: Strategies for Stealth Therapeutic Systems, Plenum, New York (1998) P. 61-75.

40. S. Yemul, C. Berger, A. Estabrook, S. Suarez, R. Edelson, H. Bayley. Selective killing of T lymphocytes by phototoxic liposomes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA V. 84 (1987) P. 246250.

41. J.A. Reddy, D. Dean, M.D. Kennedy, P.S. Low. Optimization of folate-conjugated liposomal vectors for folate receptor-mediated gene therapy // J. Pharm. Sci. V. 88 (1999) P. 11121118.

42. M.M. Quails, D.H. Thompson. Chloroaluminum phthalocyanine tetrasulfonate delivered via acid-labile diplasmenylcholine-folate liposomes: intracellular localization and synergistic phototoxicity // Int. J. Cancer V. 93 (2001) P. 384-392.

43. A. Gijsens, L. Missiaen, W. Merlevede, P. de Witte. Epidermal growth factor-mediated targeting of chlorin e6 selectively potentiates its photodynamic activity // Cancer Res. V. 60 (2000) P.2197-2202.

44. P. Opanasopit, M. Sakai, M. Nishikawa, S. Kawakami, F. Yamashita, M. Hashida. Inhibition of liver metastasis by targeting of immunomodulators using mannosylated liposome carriers // J. Control. Release V. 80 (2002) P. 283-294.

45. D. Papahadjopoulos, K. Jacobsen, S. Nir, T. Isac. Phase transitions in phospholipid vesicles. Fluorescence polarization and permeability measurements concerning the effects of temperature and cholesterol // Biochim. Biophys. Acta V. 311 (1973) P. 330.

46. G. Mouritsen, K, Jorgensen, T. Honger, Permeability of lipid bilayers near the phase transition, in: H.A. Disalvu, S.A. Simon (Eds.). Permeability and .Stability of Lipid Bilayers CRC Press, Boca Raton, FL (1994) P. 137.

47. J.B. Bassett, R.U. Anderson, J.R. Tacker. Use of temperature-sensitive liposomes in the selective delivery of methotrexate and cis-platinum analogues to murine bladder tumor // J. Urol. V. 135 (1985) P. 612-615.

48. К. Maruyama, S. Unezaki, N. Takahashi, M. Iwatsuru. Enhanced delivery of doxorubicin to tumor by long-circulating thermosensitive liposomes and local hyperthermia // Biochim. Biophys. Acta V. 1149 (1993) P. 209-216.

49. M.H. Gaber, K. Hong, S.K. Huang, D. Papahadjopoulos. Thermosensitive sterically stabilized liposomes: Formulation and in vitro studies on mechanism of doxorubicin release by bovine serum and human plasma // Pharmacol. Res. V. 12 (1995) P. 1407.

50. D. Needham, M. Dewhirst. The development and testing of a new temperature-sensitive drug delivery system for the treatment of solid tumors // Advanced Drug Delivery Reviews V. 53 (2001) P. 285-305.

51. D.C. Drummond, M. Zignani, J.-C. Leroux. Current status of pH-sensitive liposomes in drug delivery // Progress In Lipid Research V. 39 (2000) P. 409-460.

52. L.D. Mayer, M.B. Bally, P.R. Cullis. Uptake of adriamycin into large unilamellar vesicles in response to a pH gradient // Biochim. Biophys. Acta V. 857 (1986) P. 123-126.

53. L.D. Mayer, L.C.L. Tai, M.B. Bally, G.N. Mitilenes, R.S. Ginsberg, P.R. Cullis. Characterization of liposomal systems containing doxorubicin entrapped in response to pH gradients // Biochim. Biophys. Acta V. 1025 (1990) P. 143-151.

54. X. Li, D.J. Hirsh, D. Cabral-Lilly, A. Zirkel; S.M. Gruner, A.S. Janoff, W.R. Perkins. Doxorubicin physical state in solution and inside liposomes loaded via a pH gradient // Biochim Biophys Acta V. 1415 (1998) P. 23^10.

55. Государственная фармакопея СССР, XI изд. вып. 2, Москва.: Медицина, 1987. Т. 1, С. 336; Т. 2, С. 397.

56. А.С. Chakrabarti, I. Clark-Lewis, P.R. Cullis. Influence of charge, charge distribution, and hydrophobicity on the transport of short model peptides into liposomes in response to transmembrane pH gradients // Biochemistry V. 33 (1994) P. 8479-8485.

57. L.D. Mayer, M.B. Bally, H. Loughrey, D. Masin, P.R. Cullis. Liposomal vincristine preparations which exhibit decreased drug toxicity and activity against murine LI210 and P388 tumors // Cancer Res. V. 50 (1990) P. 575-579.

58. N.L. Boman, D. Masin, L.D. Mayer, P.R. Cullis, M.B. Bally. Liposomal vincristine which exhibit increased drug retention and increased circulation longevity cures mice bearing P388 tumors // Cancer Res. V. 54 (1994) P. 2830-2833.

59. P.R. Cullis, M.J. Hope, M.B. Bally, T.D. Madden, L.D. Mayer. Influence of pH gradients on the transbilayer transport of drugs, lipids, peptides and metal ions into large unilamellar vesicles // Biochim. Biophys. Acta V. 1331 (1997) P. 187-211.

60. Liposomes: A Practical Approach, Second Edition; Edited by V. Torchilin and V. Weissig // Oxford University Press, 2003.

61. R. Cohen, G. Haran, L.K. Bar, Y. Barenholz // 15th Int. Cong. Biochem. Abstracts. (1991) P. 97.

62. D.D. Lasic, P.M. Frederick, M. Stuart, Y. Barenholz, T.J. Mcintosh. Gelation of liposome interior. A novel method for drug encapsulation. // FEBS Letters V. 312 (1992) P. 255-258.

63. S. Clerc, Y. Barenholz. Loading of amphipathic weak acids into liposomes in response to transmembrane calcium acetate gradients. // Biochim. Biophys. Acta V. 1240 (1995) P. 257-265.

64. И.В.Жигальцев, С.Н.Коломейчук, А.П.Каплун, В.Г.Кучеряну, В.В.Юрасов, В.И.Швец. Концентрирование допамина в липосомах с помощью трансмембранного градиента концентрации сульфата аммония // Биоорган, химия Т. 25 (1999) № 5. С. 404-408.

65. British pharmacopoeia // London, V. 1 (2001)

66. Регистр лекарственных средств России // Москва: PJIC, 6 изд., 2000, С. 750-769.

67. М.Д. Машковский. Лекарственные средства // Москва: Новая волна, 2002, Т. 2., С. 437.

68. Энциклопедия клинической онкологии. Регистр лекарственных средств России. // Москва: ООО РЛС-2004,12 изд., 2004, С. 218-221.

69. Информация о лекарственных средствах специалистов здравоохранения. Лекарственные средства, применяемые в онкологии. // Москва: РЦ Фарммединфо, 1999, С.92-99

70. М. J. During, A. Freese, A.Y. Deutch et al. Biochemical and behavioral recovery in a rodent model of Parkinson's disease following stereotactic implantation of dopamine-containing liposomes // Exp. Neurol. V. 115 (1992) N. 2, P. 193-199.

71. M. Harrison, D. Tomlinson, S. Stewart. Liposomal entrapped doxorubicin: an active agent in AIDS - related Kaposi sarcoma // J. Clin. Oncol. V. 13 (1995) P. 914-920.

72. D. J. Adams. The Impact of Tumor Physiology on Camptothecin-Based Drug Development // Curr. Med. Chem. Anti-Cancer Agents V. 5 (2005) P. 1-13.

73. S. M. Deyev, R. Waibel, E. N. Lebedenko, A. P. Schubiger, A. Pluckthun. Design of multivalent complexes using the barnase-barstar module // Nature Biotechnology V. 21 (2003) N. 12, P. 1486-1492.

74. T. P. Derksen, G. L. Scherphof. An improved method for covalent coupling of proteins to liposomes // ВВА V. 814 (1985) P. 151-155.

75. В.И. Кленин, С.Ю. Щеголев, В.И. Лаврушин. Характеристические функции светорассеяния дисперсных систем // Издательство Саратовского университета, 1977, С. 176.

76. Ю. А. Владимиров, Г. Е. Добрецов. Флуоресцентные зонды в исследовании биологических мембран // Москва: Наука, 1980,320 с.

77. J. P. Costanzo, R. Е. Lee, Jr. Cryoprotection by urea in a terrestrially hibernating frog // J. Experim. Biol. V. 208 (2005) P. 4079-4089.

78. W. Wray, T. Boulikas, V.P. Wray, R. Hancock. Silver staining of proteins in polyacrylamide gels //Anal Biochem (1981) P. 118-197.

79. J. W. Slot, H. J. Geutze. A new metjod of preparing gold probes for multiply-labelling cytochemistry//Eur. J.Cell Biol. V. 38 (1985) P. 87-93.

80. J. Roth. Post-embedding cutochemistry with gold-labelled reagents: a review // J. Microsc. V. 143 (1986) P. 125-137.