Создание неиммунной комбинаторной библиотеки одноцепочечных антител человека и получение из этой библиотеки антител против фактора некроза опухоли альфа тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Батанова, Татьяна Александровна

• Батанова, Татьяна Александровна
• кандидат биологических наук
• 2005

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Батанова, Татьяна Александровна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

Введение.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ФАГОВЫЙ ДИСПЛЕЙ.

1.1. Биология нитчатого бактериофага.

1.2. Типы векторных систем на основе Ff-бактериофагов.

1.3. Комбинаторные фаговые библиотеки пептидов.

1.4. Комбинаторные фаговые библиотеки антител.

1.5. Фактор некроза опухоли альфа.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ. 3.1. Конструирование комбинаторной неиммунной библиотеки . одноцепочечных антител человека.

3.2. Характеризация сконструированной библиотеки одноцепочечных антител человека.

3.3. Получение одноцепочечных антител человека к ФНО-а в растворимой форме.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Создание неиммунной комбинаторной библиотеки одноцепочечных антител человека и получение из этой библиотеки антител против фактора некроза опухоли альфа»

Актуальность темы. В последнее время рекомбинантные антитела человека все чаще находят применение в терапии некоторых заболеваний. Одним из подходов к получению искусственных антител является конструирование одноцепочечных антител (бсРу), представляющих собой вариабельные домены тяжелых и легких цепей, объединенных пептидным линкером в единую молекулу. Обладая небольшими размерами, одноцепочечные антитела беспрепятственно проникают в ткани и вызывают меньший неспецифический иммунный ответ. Кроме того, одноцепочечные антитела быстрее выводятся из организма, что является преимуществом при лечении некоторых паталогических состояний. Кроме того, на основе одноцепочечных антител могут быть сконструированы полноразмерные антитела человека путем объединения вариабельных доменов исходных одноцепочечных антител с константными доменами иммуноглобулинов человека. Одним из способов получения одноцепочечных антител является их отбор из комбинаторных библиотек методом фагового дисплея. При этом ключевым этапом является конструирование комбинаторной фаговой библиотеки, которая представляет собой популяцию бактериофагов, каждый из которых экспонирует на своей поверхности уникальное миниантитело, и в ходе процедуры аффинной селекции с использованием целевого антигена можно отобрать фаговые антитела против этого антигена.

Фактор некроза опухоли (ФНО-а) является главным медиатором острого воспалительного ответа на грамотрицательные бактерии и другие инфекционные агенты. Основная роль его заключается в способности индуцировать провоспалительные медиаторы, такие как ИЛ-1, ИЛ-6 и гранулоцитарный макрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ), а также белки-хемоатграктанты. Известно, что главным стимулятором запуска продукции ФНО макрофагами является бактериальный липополисахарид, а основным источником ФНО-а в организме являются активированные мононуклеарные фагоциты, хотя стимулированные Т-клетки, натуральные киллеры (1ЧК-клетки) и тучные клетки также могут секретировать этот белок.

При тяжелых инфекциях, ФНО-а, продуцируемый в большом количестве, может вызывать системные клинические и патологические проявления. ФНО-а, воздействуя на гипоталамус, индуцирует лихорадку, увеличивая синтез простагландинов цитокин-стимулированными клетками гипоталамуса. Кроме того, ФНО-а оказывает воздействие на печень, в частности, увеличивая синтез гепатоцитами сывороточных воспалительных белков, а также вносит ощутимый вклад при развитии локальных воспалительных реакций. Пролонгированная продукция ФНО-а вызывает и метаболические повреждения, включая кахексию. Таким образом, повышенная концентрация ФНО-а в сыворотке крови человека приводит к развитию большого числа системных нарушений. Поэтому, факторы, блокирующие действие данного цитокина, являются многообещающими в терапии ряда патологий, включая вирусные гемморрагические лихорадки и аутоиммунные заболевания. К таким факторам можно отнести растворимые рецепторы ФНО-а, ингибиторы синтеза и высвобождения ФНО-а и специфические антитела к ФНО-а. В настоящее время наиболее перспективными в медицине считаются человеческие моноклональные антитела. Однако получение человеческих моноклональных антител с помощью традиционной гибридомной технологии не удовлетворяет требованиям, предъявляемым к медицинским препаратам, что создает необходимость поиска альтернативных терапевтических средств. Поэтому особенно актуально получение рекомбинантных антител человека против ФНО-а.

Для получения рекомбинантных антител человека против ФНО-а, необходимо было на первом этапе сконструировать представительную комбинаторную фаговую библиотеку антител человека, а затем отобрать из нее высокоспецифичные рекомбинантные антитела против ФНО-а. Следует отметить, что если сконструированная библиотека обладает большой представительностью, то такая библиотека может послужить источником практически неограниченного спектра антигенов.

Цель данной работы заключалась в конструировании неиммунной (наивной) фаговой библиотеки одноцепочечных антител человека, отборе из полученной библиотеки одноцепочечных антител к ФНО-а человека и изучение их иммунохимических свойств.

В соответствии с поставленной целью необходимо было решить следующие задачи:

- сконструировать неиммунную комбинаторную библиотеку одноцепочечных антител человека на основе лимфоцитов периферической крови доноров и оценить размер и представительность полученной библиотеки;

- отобрать из полученной библиотеки фаговые антитела, специфически направленные к ФНО-а человека человека и исследовать их специфичность и хаактер связывания с этим антигеном ;

- сконструировать штаммы Escherichia coli, продуцирующие одноцепочечные антитела человека против ФНО-а в растворимой форме;

- получить очищенные одноцепочечные антитела человека против ФНО-а, подтвердить их специфичность и определить аффинность;

- определить аминокислотные последовательности полученных одноцепочечных антител.

Научная новизна и практическая ценность работы. В настоящей работе впервые в нашей стране сконструирована нативная неиммунная фаговая библиотека одноцепочечных антител человека на основе лимфоцитов периферической крови здоровых доноров, представительность которой составила 2x108 независимых клонов. Проведенные эксперименты подтвердили возможность отбора из сконструированной библиотеки антител против различных антигенов, включая цельновирионный вирус осповакцины, коровый белок вируса гепатита В, образующий вирусоподобные частицы в результате самосборки продукции его в клетках E.coli, и цитокин ФНО-а человека. В дальнейшем сконструированная библиотека может быть использована для получения из нее одноцепочечных антител человека против широкого спектра антигенов.

В результате проделанной работы впервые в России получены штаммы Escherichia coli, продуцирующие растворимые одноцепочечные антитела sAl и sB3 против ФНО-а и оценена продуктивность этих штаммов. Показана специфичность взаимодействия полученных одноцепочечных антител с ФНО-а человека и определены их константы аффинности. Определены аминокислотные последовательности полученных антител. На основе полученных антител в дальнейшем могут быть сконструированы полноразмерные антитела человека, специфично взаимодействующие с ФНО-а.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Батанова, Татьяна Александровна

выводы

Сконструирована натуральная неиммунная комбинаторная библиотека фаговых антител человека, размер которой составил 2х108 независимых клонов. Показано, что эта библиотека обеспечивает получение одноцепочечных антител в растворимой форме.

Методом аффинной селекции отобраны 6 фаговых антител против ФНО-а, 7 антител против вируса осповакцины и 4 антитела против НВс-антигена. Показано, что 2 из 6 фаговых антител против ФНО-а способны выявлять этот белок в иммуноблоте; все 4 фаговых антитела против НВс-антигена связывают белок с молекулярным весом 24кДа, соответствующий коровому белку вируса гепатита В; из 7 антител, связывающие вирус осповакцины, 2 выявляют белок с молекулярным весом 27 кДа, а одно антитело - белок с молекулярным весом около 54-56 кДа.

Исследована специфичность полученных антител против ФНО-а в реакциях связывания с различными антигенами и показано, что все они не взаимодействовали с вирусом осповакцины, коровым белком вируса гепатита В, бычьим сывороточным альбумином и убиквитином; пять из отобранных антител не связывали овальбумин. Показана способность пяти антител выявлять 80 нг ФНО-а при разведении фаговых антител до 4х109 БОЕ/мл, что соответствует 1,7х10"16 M одноцепочечных антител. Впервые получены штаммы Е.coli-sAl и E.coli-sB3, продуцирующие в растворимой форме одно-цепочечные антитела sAl и sB3 против ФНО-а с уровнем продукции 270 и 210 мкг на литр культуры, соответственно. Определены константы аффинности полученных антител в реакции связывания с рекомбинантным белком ФНО-а человека, которые составили для антитела sAl - 3,96±0,52х108М"1, а для антитела sB3 -7,32±0,52х 107М"!.

Определены аминокислотные последовательности одноцепочечных антител эА1 и бВЗ и показано, что У-сегмент тяжелой цепи антитела эА1 относится к семейству УЬ23, а У-сегмент тяжелой цепи антитела эВЗ - к семейству УЪ20 III типа тяжелых цепей иммуноглобулинов человека; V-сегменты легких цепей антител эА1 и эВЗ принадлежат к группе к-цепей.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор считает приятным долгом поблагодарить своего руководителя - к.б.н. Тикунову Нину Викторовну за организацию работы и неоценимую поддержку. Автор выражает глубокую признательность к.х.н. Ламану Александру Георгиевичу, Улитину Андрею Борисовичу и к.х.н. Шепеляковской Анне Олеговне за обучение, консультации и техническую помощь в работе. Также автор благодарит директора НИИ Биоинженерии д.б.н. профессора Ильичева Александра Алексеевича за организационные моменты, к.б.н. Карпенко Ларису Ивановну, к.м.н. Беланова Евгения Федоровича и к.х.н. Шингарову Людмилу Николаевну за предоставленные для работы антигены, д.б.н. Локтева Валерия Борисовича и к.б.н. Ильичеву Татьяну Николаевну за внимательное рецензирование диссертационной работы автора.

Самую теплую благодарность хочется выразить Матяш Ирине Викторовне, чье терпение и трудолюбие способствовали выполненю работы, а также всем сотрудникам НИИ Биоинженерии за советы и научные дискуссии, которые несколько скрашивали тяжелые условия сегодняшней научной действительности.

Заключение

В результате проделанной работы из лимфоцитов периферической крови 6 здоровых доноров была выделена РНК и синтезированы гены, кодирующие вариабельные домены тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов человека. На основе стохастического объединения фрагментов ДНК, кодирующих тяжелые и легкие цепи антител человека с помощью соответсвующего ДНК-линкера, в формате фагового дисплея сконструирована неиммунная (наивная) фаговая библиотека одноцепочечных антител человека, представительность которой о составила 2x10 независимых рекомбинантных клонов. Определение функционального размера библиотеки показало, что не менее 90% клонов библиотеки содержали фрагмент ДНК, кодирующий одноцепочечное антитело, и подтвердило возможность получения одноцепочечных антител человека в растворимой форме без оболочечного белка бактериофага.

Для подтверждения возможности отбора из сконструированной библиотеки антител против широкого спектра антигенов была проведена селекция из нее фаговых антител против ряда различных по своей природе антигенов, антитела к которым не присутствовали в сыворотках крови, использованных для конструирования библиотеки. В качестве таких антигенов были выбраны цельновирионный вирус осповакцины (ВОВ), вирусоподобные частицы, образованные в результате продукции корового белка вируса гепатита В, и цитокин ФНО-а. В результате проведенных экспериментов была продемонстрирована возможность получения фаговых антител против широкого спектра антигенов.

Кроме того, из сконструированной библиотеки были отобраны 6 различных антител, специфичных к ФНО-а человека, что было подтверждено методами непрямого твердофазного иммуноферментного анализа и Western-блот анализа. Дальнейшие иммунохимические исследования 6 уникальных фаговых антител, отобранных против ФНО-а человека, позволили отобрать из них два одноцепочечных антитела для получения их в растворимой форме. В результате были получены штаммы-продуценты двух одноцепочечных антител, проведены исследования их уровня продукции и свойств методом ТИФА и иммуноблотинга, определаны их аминокислотные последовательности. Кроме того, получение двух одноцепочечных антител в растворимой форме позволило оценить их аффинность. По экспериментальным данным, полученным при исследовании связывания последовательных разведений одноцепочечных растворимых антител с ФНО-а человека, с помощью программы Origin 7.0 были рассчитаны значения констант аффинности для двух антител. Они составили 3,96±0,52хЮ8М"1 для одного антитела и 7,32+0,52* 107M"! для другого. Следует

7 я отметить, что для фагмидных библиотек размера 10' - 10° клонов типично получение высокоспецифичных, но низкоаффинных антител с константами аффинности порядка 106 М"1. Однако в нашем случае были получены антитела с

7 1 о 1 константами- аффинности ЮМ" и что может быть объяснено условиями отбора рекомбинантных фагмид, а именно, снижением концентрации лиганда на последней стадии отбора, уменьшением времени инкубации лиганда с фаговыми частицами, а также ужесточением процедуры отмывки. Поскольку в результате работы были получены человеческие одноцепочечные антитела, на их основе в дальнейшем Moiyr быть сконструированы полноразмерные антитела человека. Такие полноразмерные антитела человека, взаимодействующие с ФНО-а, могли бы представлять большой интерес для терапии ряда заболеваний, в частности, для лечения вирусных гемморрагических лихорадок и аутоиммунных заболеваний.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Батанова, Татьяна Александровна, 2005 год

1. Альберте Б., Брей Д., Льюис Дж., Рэфф М., Роберте К., Уотсон Дж. Молекулярная биология клетки. Мир, Москва. 1994. - Том 3. - С. 215-283.

2. Берзовски Д., Берковер Д. Взаимодействие антиген-антитело. Иммунология (под ред. У.Пол). Мир, Москва. 1989. - Том 3. С. 5-89.

3. Варфоломеев С .Д., Гуревич К.Г. Биокинетика: Практический курс. Москва: ФАИР-ПРЕСС. -1999.

4. Галактионов В.Г. Иммунология. Москва. 2000. - С. 486.

5. Досон Р., Элиот Д., Элиот У., Джонс К. Справочник биохимика. Москва, Мир. 1991.-С.466.

6. Ильичев A.A., Меламед Н.В., Тикунова Н.В. Нитевидный бактериофаг М13 в бинарной системе экспрессии, основанной на РНК-полимеразе Т7. Биотехнология. 1997. - Т. 1. - С. 12-20.

7. Кузьмичева Г.А., Кувшинов, В.Н., Разумов, И.А., Иванисенко, В.А., Ерошкин,

8. A.M., Мишин, В.П., Ушакова, Т.А., Локтев В.Б, Ильичев, А.А. Использование фаговой библиотеки пептидов в картировании группоспецифического гемагглютинирующего домена гликопротеина Е2 альфа-вирусов. Мол.Ген. — 1997.-Т. 4.-С. 25-28.

9. Ляшенко В.А., Воробьев А.А. Молекулярные основы иммуногенности антигенов. М.:Медицина. 1982. - С.76-99.

10. Миненкова, О.О., Ильичев, А.А., Кищенко, Г.П., Ильичева, Т.Н., Хрипин Ю.Л., Орешкова С.Ф., Петренко В.А. Получение специфического иммуногенеза на основе бактериофага М13. Мол. Биол. 27, вып.З. -1993. С. 561-568.

11. Тикунова, Н.В., Колокольцов, А.А., Чепурнов А.А. Рекомбинантные моноклональные антитела человека против вируса Эбола. ДАН. Т.378. -2001. - С.551-554.

12. Фрейдлин И.С., Тотолян А.А. Клетки иммунной системы. СПб. Наука. 2001.

13. Шингарова Л.Н., Сагайдак Л.Н., Турецкая Р.Л., Недоспасов С.А., Есипов Д.С., Коробко В.Г. Мутанты фактора некроза опухолей человека: получение и некоторые свойства. Биоорганическая химия. 1996. - Т.22 (4). - С. 243-251.

14. Abbas, А.К., Lightman, А.Н., Pober, J.S. Cellular and Molecular Immunology. Fourth Edition, 553. 2000. P. 240-242,244-246.

15. Aversa G., Punnonen J., de Vries JE. The 26-kDa transmembrane form of tumor necrosis factor a on activated CD4+ T cell clones provides a costimulatory signal forhuman B-cell activation. J. Exp. Med. 1993. - v. 177. - P. 1575-1585.

16. Barbas C.F., Bain J.D., Hoekstra, DM. and Lerner, R.A. Semisynthetick combinatorial Ab libraries: a chemical solution to the diversity problem. Proc.Natl.Acad. Sci. USA. 89. - 1992. P. 4445-4457.

17. Barbas CF. Ill, Kang A.S., Lerner R.A., Bencovic SJ. Assembly of combinatorial antibody libraries on phage surface: The gene III site. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -88.- 1991.- P. 7978-7982.

18. Barbas III C.F., Lerner R.A. Combinatorial immunoglobulin library on the surface of phage (Phabs):rapid selection of an antigen specific Fabs. A companion to Meth. In Enzimology. 2. - 1991. P. 119-124.

19. Barbie V., Lefrans MP. The human immunoglobulin kappa variable (IGKV) genes and joining (IGKJ) segments. Exp Clin Immunogenet. 1998. -v.l5(3). - P. 171183.

20. Beck E., Zink B. Nucleotide sequence and genome organisation of filamentous bacteriophages fl and fd. Gene. 1981. - 16(1-3). - P. 35-58.

21. Better M., Chang CP., Robinson RR., Horwitz AH. Escherichia coli secretion of an active chimeric antibody fragment. Science. 240.-1988.- P. 1041-1043.

22. Bond Ch., Marsters J.C., Sidhu S. Contributions of CDR3 to VHH Domain Stability and Design of Monobody Scaffolds for Naive Antibody Libraries. J. Mol. Biol. V.332, P.643-655,2003.

23. Boyle P., Lembach KJ., Wetzel GD. The B5 monoclonal human autoantibody binds to cell surface TNF alpha on human lymphoid cells and cell lines and appears to recognize a novel epitope. Cell Immunol. 1993. - 152(2). - P. 569-581.

24. Brinckmann U., Pai LH., FitzGerald DJ., Willingham M., Pastan I. B3(Fv)-PE38KDEL, a single-chain immunotoxin that causes complete regression of a human carcinoma in mice. Proc Natl Acad Sci USA.- 1991. v. 1(19). - P. 86168620.

25. Burton D.R., Barbas C.F., Persson M.A., Koenig S., Chanock R.M., Lerner R.A. Proc.Natl.Acad.Sci. 1991. - Vol. 88. - P. 134-137.

26. Carlson DL., Willis MS., White DJ., et al., Tumor necrosis factor-alpha-induced caspase activation mediates endotoxin-related cardiac dysfunction. Crit Care Med. -2005. May;33(5). - P. 1021-8.

27. Chaundhaiy V.K., Gallo MG., FitzGerald DJ., Pastan I. A recombinant single-chain immunotoxin composed of anti-Tac variable regions and a truncated diphtheria toxin. Proc Natl Acad Sci USA.- 1990. 87(23). - P. 9491-9494.

28. Clackson T. et al. Making antibody fragments using phage display libraries. Nature. 352.- 1991.- P. 624-628.

29. Clackson T., Lowman H. Phage Display: A Practical Approach. Eds. Oxford University Press, 2001 in press.

30. Desidero, A., Fanconi, R., Lopez, M., E., V., M., Viti, F., Chiaraluce, R. A semisynthetic repertoire of intrinsically stable antibody fragments derived from a singleframework scaffold. J. Mol. Biol. -310.-2001. P. 603-615.

31. Dorsam H., Rohrbach P., Kurscher T., Kipriyanov S., Renner S., Braunagel M., Welschof M., Little M. Antibodies to steroids from a small human naive IgM library. FEBS Lett. 1997. - 1. - P. 7-13.

32. Elliot MJ., Maini RN., Feldman M. Randomised double-blind comparison of chimeric monoclonal antibody to tumor necrosis facror alpha (ca2) versus placebo in rheumatoid arthtritis. Lancet. 344. - 1994. P. 1105-1110.

33. Ewert, S., Huber, T., Honegger, A., Pluckthun A. Biophysical properties of human antibody variable domains. J.Mol. Biol. 2003. - V.325. - P. 531-553.

34. Fendly BM., Toy KJ., Creasey AA., Vitt CR., Larrick JW., Yamamoto R., Lin LS. Murine monoclonal antibodies defining neutralizing epitopes on tumor necrosis factor. Hybridoma. 1987. - v.6(4). - P. 359-370.

35. Fiers W. Tumor necrosis factor: characterization at the molecular, cellular and in vivo level. FEBS Letters. 285. - 1991. - P. 199-219.

36. Forrer, P., Jung, S., Pluckthun, A. Beyond binding: Using phage-display to select for structure, folding and enzymatic activity in proteins. Curr. Opin. Struct. Biol. -1999.-v. 9.-P. 514-520.

37. Fuchs P., Breitling F., Dubel S., Seehaus T., Dubel S., Little M. Targeting recombinant antibodies to the surface of Escherichia coli: Fusion to a peptidoglycan associated lipoprotein. Bio/Technology. 9. - 1991. - P. 1369-1372.

38. Gavilondo JV., Larrick JW. Antibody engineering at the millennium. Biotechniques. 2000. - v. 29(1). - P. 128-132.

39. Ghahroudi, A., Desmyter, A., Wyns, L., Hamers, R., & Muyldermans, S. Selection and identification of single domain antibody fragments from camel heavy-chain antibodies. FEBS Letters. 414. - 1997. P. 521-526.

40. Griffiths A.D., Duncan A.R. Strategies for selection of antibodies by phage display. Curr. Opin. Biotech. 1998. - v. 9. - P. 102-108.

41. Griffiths, A.D., Dunkan, A.R. Strategies for selection of antibodies by phage display. Curr. Opin. Biotech. 9. - 1998. P. 102-108.

42. Hanh T., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1985. - 82. - P. 3814-3818.

43. Hames-Casterman, C., Atarhouch, T., Muyldermans, S., Robinson, G., Hames, C., Songa, EB., Bendahman, N., Hames, R. Naturally occurring antibodies devoid of light chains. Nature. 363. - 1993. P. 446-458.

44. Hawkins R.E., Russel S.K., Winter G. Selection of phage antibodies by binding affinity. Mimicking naive combinatorial library. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1992.-v. 89.-P. 3576-3580.

45. Hirai M., Okamura N., Terano Y., Tsujimoto M., Nakazato H. Production and characterization of monoclonal antibodies to human tumor necrosis factor. J Immunol Methods. 1987. - v. 26(1). - P. 57-62.

46. Hoess R.H., Brinkmann U., Handel T., Pastan I. Isentification of a peptide wich binds to the carbohydrate-specific monoclonal antibody B3. Gene. 1993. - v. 128. -P. 43-49.

47. Hoess, R.H. Protein design and phage display. Chem. Rev. 2001. - v. 101. - P. 3205-3218.

48. Huber C., Schable,K.F., Huber,E., Klein,R., Meindl,A., Thiebe,R. Lamm,R. Zachau,H.G. The V kappa genes of the L regions and the repertoire of V kappa gene sequences in the human germ line Eur.J.Immunol. -1993. 23 (11). - P. 2868-2875.

49. Huse WD, Iverson SA., Kang AS., Alting-Mees M., Burton DR., Bencovic SJ., Lerner RA. Generation of large combinatorial library of the immunoglobulin repertoire in phage lambda. Science. 246. - 1989. - P. 1275-1281.

50. Ippen-Ihler K., Maneewannekul S. Conjugation among enteric bacteria: Mating systems dependent on expression of pili. In: «Microbial cell-cell interactions». -1991.-P. 35-69.

51. Jager, M., Plucthun, A. Domain interactions in antibody Fv and scFv fragments: effects on unfolding kinetics and equilibria. FEBS Letters. 1999. - v. 462. - P. 307312.

52. Jones E.Y., Stuart D.I., Walker N.P. Nature. 1989. -v. 338. - P. 225-228.

53. Jung, S., Honegger, A., Pluckthun, A. Selection for improved protein stability by phage display. J. Mol. Biol. 1999. - v. 294. -P. 163-180.

54. Kang AS., Barbas CF., Janda KD., Bencovic SJ., Lerner RA. Linkage of recognition and replication functions by assembling combinatorial antibody Fab libraries along phage surfaces. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 88.-1991.- P. 4363-4366.

55. Kawasaki K., Minoshima S., Nakato E., Shibuya K., Shintani A., Schmeits JL., Wang J., Shimizu N. One-megabase sequence analysis of the human immunoglobulin lambda gene locus. Genome Res. 1997. - v. 7. - P. 250-261.

56. Kay B.K., Winter G., McCafferty J. Phage display of peptides and proteins: a laboratory manual. Academic press. 1996. - P.306.

57. Kempeni J. Preliminary results of early clinical trials with the fully human anti-TNFa monoclonal antibody D2E7. Ann. Rheum. Dis. 58. - 1999. - P. 170-172.

58. Kieke MC., Cho BK., Boden ET., Kranz DM., Wittrup KD. Isolation of anti-T cell receptor scFv mutants by yeast surface display. Protein Eng. 1997. - v. 10(11). -P. 1303-1310.

59. Kim S J., Myeong HJ., Stapleton J.T., Yoon S.O., Kim K., Jeon E., Hong L. Neutralizing human monoclonal antibodies to hepatitis A virus recovered by phage display. Virology. 2004. - v. 318. - P. 598-607.

60. Konur A., Schulz U., Eissner G., Andreesen R., Holler E. Interferon (IFN)-gamma is a main mediator of keratinocyte (HaCaT) apoptosis and contributes to autocrine4

61. N-gamma and tumour necrosis factor-alpha production. Br J Dermatol. 2005. -v. 152(6).-P. 1134-42.

62. Krebs, B., Griffin, H., Winter, G., Rose-John, S. Recombinant human single chain Fv antibodies recognizing human interleukin-6.

63. Kreitman R.G.Immunotoxins in cancer therapy. Curr Opin Immunol. 1999. - v. 5. - P. 570-578.

64. Laemmly U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 1970. - v. 227. - P. 680-685.

65. Lee M., Rapti M., Murphy G. Delineating the molecular basis of the inactivity of tissue inhibitor of metalloproteinase-2 against tumor necrosis factor-alpha-converting enzyme. J. of Biol. Chem. 2004. - v. 279 (43). - P. 45121-45129.

66. Lee, Ch., Sidhu, Sachdev S., Fuh, G. Bivalent antibody phage display mimics1natural immunoglobulin. J. Immunol. Meth. 284. - 2004. P 119-132. i 81. Liitle, M., Welschof, M., Braunagel, M., Hermes, I., Christ, C., Keller, A.,

67. Rohrbach, P., Kurschner T., Schmidt S., Kleist C., Terness P. Generation of a large complex antibody library from multiple donors. J. of Immunol. Meth. 1999. - v. 231.-P. 3-9.

68. Luzzago A., Felici F., Tramontano A., Pessi A., CorteseR. Mimicking ofdiscontinuous epitopes by phage-displayed library of contrained peptides. Gene. -1993.-v. 128.-P. 51-57.

69. MacCafferty, J., Griffiths, A.D., Winter, G. and Chiswell, D.J. Phage antibodies: filamentous phage displaying antibody variable domains. Nature. 348. - 1990. -P. 552-554.

70. Marks J.D., Hoogenboom H.R., Bonner T.P., McCafferty J., Griffiths A., Winter G. By passing immunization: human antibodies from V-gene libraryies displayed on phage. J. Mol. Biol. 1991. - v. 222. - P. 581-597.

71. Martin, A., Sieber, V., Shmid, F.X. In-vitro selection of highly stabilized protein variants with optimized surface. J. Mol. Biol. 2001. -v. 309. - P. 717-726.

72. Matsuda F., Ishii,K., Bourvagnet,P., Kuma,K., Hayashida,H., Miyata,T., Honjo,T. The complete nucleotide sequence of the human immunoglobulin heavy chain variable region locus. J Exp Med. 1998. - v. 7 (188). - P. 2151-2162.

73. Minnencova O.O., Ilyichev A.A., Kishchenko G.P. Design of specific immunogenes using filamentous phage at the carrier. Gene. 1993. - v. 128. - P. 85-88.

74. Mitchell, T., Sugden, B. Stimulation of NF-kB-mediated transcription by mutant derivatives of the latent membrane protein of Epstein-Barr virus. J. Virol. 69. -1995. P.2968-2976.

75. Model, P., Russel, M. In:Calendar R.(Ed).The bacteriophages, V.2. Plenum, N.Y. 1988. P.375-456.

76. Moreland LW., Baumgartner SW., Schiff MH. Treatment of rheumatoid arthritis with a recombinant human necrosis factor receptor (p75)-Fc fision protein. N. Engl. Med. 337. - 1997. - P. 141-147.

77. Morrison CA., Williams J., Perry BN. Adjuvant-free immunological manipulation of livestock. Res Vet Sci. 1984. - v.37(l). - P.108-113.

78. Mosialos, G., Birkenbach, M., Yalamanchili, R., VanArsdale, T., Ware, C.& Kieff,

79. E. The Epstein-Barr virus transforming protein LMP1 engages signaling proteins for the tumor necrosis factor receptor family. Cell. 80. - 1995. P. 389-399.

80. Narhi L.O., Philo J.S., Li T., Zang M., Samal B., Arakawa T. Induction of alpha-helix in the beta-sheet protein tumor necrosis factor-alpha: acid-induced denaturation. Biochemistry. 1996. - v. 35. - P. 11447-11453.

81. Neuberger MS., Williams J., Fox RO. Recombinant antibodies possessing novel effector functions. Nature. 1984. - v. 312(5995). - P. 604-608.

82. Nissim, A., Hoogenboom, H., Tomlinson, Ian M., Flynn, G., Midgley, C., Lane, D., Winter, G. Antibody fragments from a 'single pot' library as immunochemical reagents. EMBO J. 13. no 3. - 1994. P. 692-698.

83. O'Neil K.T., Hoess R.H., Jackson SA., Ramachandran NS., Mousa SA., DeGrado W.F. Identification of novel peptide antagonists for GPIIb/IIIa from a conformationally constrained phage peptide library. Proteins. 1992. - v. 14. - P. 509-515.

84. Orlandi, R., Gussov, D.H., Jones, P.T., Winter, G. Cloning immunoglobulin variable domains for expression by the polymerase chain reaction. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. - V. 86. - P. 3833-3837.

85. Oram, H., Andersen, P.S., Oster, A. et al. Efficient method for constructing comprehensive murine Fab antibody libraries displayed on phage. Nucleic. Acids. Research. 1993. - v. 21. - P. 4491-4498.

86. Parmley S.F., Smith G.P. Gene. 73. -1988. - P.305-318.

87. Pasqualini RQ. Houssay and the Nobel prize. Medicina (B Aires). -1997. v. 57(5). -P. 637-40.

88. Persson MA., Caothien RH., Burton DR. Generation of diverse high-affinity human monoclonal antibodies by repertoire cloning. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88. -1991.- P. 2432-2436.

89. Rodrigues ML., Snedecor B., Chen C., Wong WL., Carg S., Blank GS., Maneval D., Carter P. Engineering Fab' fragments for efficient F(ab)2 formation in Escherichia coli and for improved in vivo stability. J Immunol. 1993. - v. 15. - P. 6954-6961.

90. Saiki, R.K., Scharf, S., Faloona, F., Mullís, K.B., Horn, G.T., Erlich, H.A., Arnheim, N. 1985. Science. V.230. P. 1350-1354.

91. Sastry, L., Alting, M.M., Huse, W.D., Short, J.M., Sorge, J.A., Hay, B.N., Janda, K.D., Benkovic, S,J., Lerner, R. Proc. Natl.Acad.Sci.USA. 1989. V.86. P.5728-32.

92. Sidhu, S.S., Lowman, H.B., Wells, J.A. Phage display for selection of novel binding peptides. Methods Enzymol. 2000. - v. 328. - P. 333-363.

93. Skerra A., Plucnhun A. Assembly of a functional immunoglobulin Fv fragment in Escherichia coli. Science. 1988. - v. 20. - P. 1038-1041.

94. Skerra, A., Pluckthun, A. Assembly of functional immunoglobulin Fv fragment in Escherichia coli. Science. 240. - 1988. - P.1038-1041.

95. Smith G.P. Filamentous fusion phage: Novel expression vectors that display cloned antigens on the surface of the virion. Science. 1985. - v.228. - P. 1315-1317.

96. Thompson JD. Applications of antisense and siRNA during preclinical drug development. Drug Discov. Today. 2002. - v. 7. - P. 912-917.

97. Tikunova, N.V., Morozova, V.V., Batanova T.A., Belanov, E.F., Bormotov, N.I., Ilyichev, A.A. Phage antibodies from combinatorial library neutralize vaccinia virus. Human Antibodies. 10. N3-4. - 2001. P.95-99.

98. Towbin H., Staehlin T., Gorden J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1979. - v. 76. - P. 4350.

99. Tse, E., Lobato, M.N., Forster, A. et al. Intracellular Antibody Capture Technology: Application to Selection of Intracellular Antibodies Recognizing the BCR-ABL Oncogenic Protein. J.Mol.Biol. 317. - 2002. P. 85-94.

100. Virnekas B., Ge L., Plucthun A., Schneider K., Wellnhofer G, Moroney S.E. Trinucleotide phosphoramidites: ideal reagents for the synthesis of mixed oligonucleotodis for random mutagenesis. Nucl.Acids Res.-1994.-v.22.-P.5600-07.

101. Ward, E.S., Gussov, D., Griffiths, A.D., Jones, P.T., Winter, G. Binding activities of a repertoire of single immunoglobulin variable domains secreted from Escherichia coli. Nature. 1989. - V.341. - P. 544-546.

102. Williams SC., Frippiat JP., Tomlinson IM., Ignatovich O., Lefrans MP., Winter G. Sequence and evolution of the human germline V lambda repertoire. J Mol Biol. -1996.-v. 29.-P. 220-232.

103. Williamson R.A., Burioni R., Sanna P.P., Partridge L.J., Barbas C.F., Burton D.R. Proc. Natl. Acad. Sci. 1993. - Vol. 90. - P. 4141-4145.

104. Williamson, R.A., Burioni, R., Sanna, P.P., Partridge, L.J., Barbas, C.F., Burton, D.R. 1993. Human monoclonal antibodies against a plethora of viral pathogens from single combinatorial libraries. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. V.90. P. 4141-4145.

105. Worne A., Plucthun A. Stability engineering of antibody single-chain Fv fragments. J. Mol. Biol. 2001. - v. 305. - P. 989-1010.

106. Wu, T.T., Johnson, G., Kabat E.A. Length distribution of CDRH3 in antibodies.

107. Proteins:Struct. Funct. Genet. V. 16. P. 1-7,1993.

108. Zailae MZ. Decreased proinflammatory cytokine production by peripheral blood mononuclear cells from vitiligo patients following aspirin treatment. Saudi Med J. -2005. v. 26(5). - P. 799-805.

109. Zhou, Y., Takekoshi, M., Maeda, F., Ihara, S., Esumi, M. Recombinant antibody Fab against the hypervariable region 1 of hepatitis С virus blocks the virus adsorption to susceptible cells in vitro. Antiviral Research. 56. - 2002. P. 51-59.

110. Yokota K., Oda S., Takesue S., Takesue Y. Intestinal disaccharidases in the house musk shrew, Suncus murinus: occurrence of sucrase deficiency. Comp Biochem Physiol. 1992. - v. 103(3). - P. 629-34.