Разработка способов направленной регуляции дегидрогеназ 2-оксокислот млекопитающих и особенности такой регуляции в клетках с разным типом метаболизма тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.08, кандидат наук Артюхов Артем Викторович

• Артюхов Артем Викторович
• кандидат наук
• 2022

Оглавление диссертации кандидат наук Артюхов Артем Викторович

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

1. ВВЕДЕНИЕ

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Дегидрогеназы 2-оксокислот

2.1.1. Общая характеристика комплексов дегидрогеназ 2-оксокислот и их основные представители

2.1.2. Механизм работы комплексов

2.1.3. Структурные компоненты комплексов дегидрогеназ 2-оксокислот

2.1.4. Изоферменты и изоформы компонентов комплексов дегидрогеназ 2-оксокислот

2.1.5. Регуляция комплексов дегидрогеназ 2-оксокислот природными системами

2.2. Тиамин в качестве фармакологического регулятора дегидрогеназ 2-оксокислот и метаболических путей с их участием

2.2.1. Физиологическая роль тиамина как предшественника кофермента дегидрогеназ 2-оксокислот

2.2.2. Регуляция метаболизма антагонистами тиамина

2.2.3. Некоферментные функции тиамина

2.3. ФОСФОНОВЫЕ И ФОСФИНОВЫЕ АНАЛОГИ 2-оксокислот в качестве синтетических ингибиторов дегидрогеназ 2-оксокислот

2.3.1. Общая характеристика

2.3.2. Химические свойства

2.3.3. Специфическое ингибирование дегидрогеназ 2-оксокислот in vitro

2.3.4. Использование в качестве регуляторов метаболизма in vivo

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3.1. Материалы

3.2. Частичная очистка комплексов дегидрогеназ 2-оксокислот из тканей крысы

3.3. Работа с клеточными культурами

3.4. Работа с животными

3.5. Биохимический анализ клеток и тканей животных и очищенных ферментов

3.5.1. Приготовление гомогенатов тканей для определения экспрессии и активностей ферментов

3.5.2. Приготовление экстрактов клеток и тканей для количественного анализа низкомолекулярных метаболитов

3.5.3. Измерение восстановительного потенциала клеток

3.5.4. Измерение концентрации белка

3.5.5. Измерение активностей ферментов

3.5.6. Вестерн-блоттинг

3.5.7. Метаболомный анализ клеточных экстрактов

3.5.8. Аминокислотный анализ экстрактов тканей

3.5.9. Измерение уровня окисленного глутатиона в тканях

3.5.10. Измерение уровня NAD+ в тканях

3.5.11. Исследование специфичности ингибирования in vitro и эффекта преинкубации

3.5.12. Исследование механизмов ингибирования и определение констант ингибирования

3.6. Работа с биоинформатическими базами данных

3.6.1. Оценка экспрессии генов на уровне мРНК

3.6.2. Оценка экспрессии генов на уровне белка

3.6.3. Филогенетический анализ гомологов ОГДГ

3.6.4. Моделирование структур ОГДГ и ОАДГ в комплексе с ТДФ и 2-оксофосфонатами

3.7. Статистический анализ

4. РЕЗУЛЬТАТЫ

4.1. Филогения дегидрогеназ 2-оксокислот из различных организмов

4.2. Экспрессия комплексов дегидрогеназ 2-оксокислот в животных тканях и их

СООТВЕТСТВИЕ АКТИВНОСТЯМ В ТКАНЯХ

4.3. КИНЕТИКА НАСЫЩЕНИЯ ОГДК И ОАДК животных 2-оксосубстратами и ИНГИБИРОВАНИЯ ИХ ФОСФОНОВЫМИ АНАЛОГАМИ

4.3.1. Насыщение ОГДК и ОАДК 2-оксосубстратами

4.3.2. Ингибирование активности ОГДК в препаратах сердца и печени

4.3.3. Ингибирование активности ОАДК в препаратах сердца и печени

4.3.4. Специфичность ингибирования ОГДК/ОАДК фосфоновыми аналогами дикарбоновых 2-оксокислот

4.4. Ингибирование ПДГК и КДГРК животных синтетическими аналогами пирувата и РАЗВЕТВЛЕННЫХ 2-ОКСОКИСЛОТ

4.4.1. Ингибирование активности ПДГК фосфоновыми и фосфиновыми аналогами пирувата

4.4.2. Ингибирование активностей КДГРК, ПДГК и ОГДК фосфоновыми аналогами разветвленных 2-оксокислот

4.5. Эффекты ингибирования дегидрогеназ 2-оксокислот в клеточных линиях зависят

ОТ СПЕЦИФИКИ КЛЕТОЧНОГО МЕТАБОЛИЗМА

4.5.1. Эффекты ингибиторов ОГДК и ОАДК на клеточный метаболизм

4.5.2. Эффекты ингибиторов ПДГК на клеточный метаболизм и жизнеспособность

4.6. БИОХИМИЧЕСКИЕ последствия регуляции дегидрогеназ 2-оксокислот в мозге животных

4.6.1. Эффекты ингибиторов ОГДК

4.6.2. Эффекты ингибиторов ОАДГ

4.6.3. Эффекты ингибиторов ПДГК

4.6.4. Эффекты тиамина как физиологического активатора дегидрогеназ 2-оксокислот, зависящие от времени суток

4.6.5. Долгосрочные последствия однократного воздействия на дегидрогеназы 2-оксокислот

5. ОБСУЖДЕНИЕ

5.1. РОЛЬ ИЗОФЕРМЕНТОВ ДЕГИДРОГЕНАЗ 2-ОКСОКИСЛОТ В МЕТАБОЛИЗМЕ И ЕГО РЕГУЛЯЦИИ

5.2. ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ ФОСФОНАТОВ КАК ВЫСОКОСПЕЦИФИЧНЫХ РЕГУЛЯТОРОВ ДЕГИДРОГЕНАЗ 2-ОКСОКИСЛОТ

5.3. ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ РЕГУЛЯТОРОВ ДЕГИДРОГЕНАЗ 2-ОКСОКИСЛОТ

5.3.1. Моделирование патологической дисфункции дегидрогеназ 2-оксокислот

5.3.2. Ингибирование дегидрогеназ 2-оксокислот с целью снижения патологических симптомов

5.3.3. Использование регуляторов дегидрогеназ 2-оксокислот в биотехнологии, сельском хозяйстве и системной биологии

5.3.4. Возможные долгосрочные последствия регуляции дегидрогеназ 2-оксокислот

6. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

7. ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ

8. БЛАГОДАРНОСТИ

9. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

10. ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Список используемых сокращений

2-ОА, OA - 2-оксоадипат 2-OG, OG - 2-оксоглутарат 2-OIV - 2-оксоизовалерат

AEBSF - 4-(2-аминоэтил)бензилсульфонилфторид

BCKDK - киназа дегидрогеназы разветвлённых 2-оксокислот

BCKDP - фосфатаза дегидрогеназы разветвлённых 2-оксокислот

CoASH - кофермент А

CTB - CellTiterBlue

DLST - дигидролипоамидсукцинилтрансфераза DLD - дигидролипоамиддегидрогеназа

DHTKD1 - белок 1, содержащий дегидрогеназный и транскетолазный домены

DMEM - среда Игла, модифицированная по Дульбекко

FCS - фетальная бычья сыворотка

FAD - флавинадениндинуклеотид

HBSS - сбалансированный солевой раствор Хэнкса

MOPS - 3-(Ы-морфолино)пропансульфоновая кислота

MTT - 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-тетразолий

NAD(P)+ - никотинамидадениндинуклеотид(фосфат), окисленная форма

NAD(P)H - никотинамидадениндинуклеотид(фосфат), восстановленная форма

OGDH - 2-оксоглутаратдегидрогеназа

OGDHL - 2-оксоглутаратдегидрогеназа-подобный белок

PDK - киназа пируватдегидрогеназы

PDP - фосфатаза пируватдегидрогеназы

PDPR - регуляторная субъединица фосфатазы пируватдегидрогеназы Pyr - пируват

RIPA - радиоиммуннопреципитационный анализ

SDS - додецилсульфат натрия

SEM - стандартная ошибка среднего

АДФ - аденозин-5'-дифосфат

АФ - адипоилфосфонат

АТФ - аденозин-5'-трифосфат

АцФ - ацетилфосфонат

АцФH - ацетилфосфинат

АцФМе - метиловый эфир ацетилфосфоната АцФМеН - ацетил(метил)фосфинат АцФМе2 - диметиловый эфир ацетилфосфоната БСА - бычий сывороточный альбумин ГДГ - глутаматдегидрогеназа ГС - глутаминсинтаза ГФ - глутарилфосфонат ДТТ - дитиотреитол

ДГРК - дегидрогеназа разветвлённых 2-оксокислот

ИЦДГ - КЛВР+-зависимая изоцитратдегидрогеназа

КДГРК - комплекс дегидрогеназы разветвлённых 2-оксокислот

МДГ - малатдегидрогеназа

МФ - КЛВР+-зависимый малик-фермент

ОАДГ - 2-оксоадипатдегидрогеназа, 2-оксоадипатдегидрогеназный

ОАДК - 2-оксоадипатдегидрогеназный комплекс

ОГДГ - 2-оксоглутаратдегидрогеназа, 2-оксоглутаратдегидрогеназный

ОГДК - 2-оксоглутаратдегидрогеназный комплекс

ПДГ - пируватдегидрогеназа, пируватдегидрогеназный

ПДГК - пируватдегидрогеназный комплекс

ПЭГ - полиэтиленгликоль

СФ - сукцинилфосфонат

ТДФ - тиаминдифосфат

ТМАФ - триметиловый эфир адипоилфосфоната

ТЭАФ - триэтиловый эфир адипоилфосфоната

ТЭГФ - триэтиловый эфир глутарилфосфоната

ТЭСФ - триэтиловый эфир сукцинилфосфоната

ФЭСФ - фосфоноэтиловый эфир сукцинилфосфоната

ЭГТА - этиленгликоль-бис(Р-аминоэтил)-тетрауксусная кислота

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

1. Введение

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка способов направленной регуляции дегидрогеназ 2-оксокислот млекопитающих и особенности такой регуляции в клетках с разным типом метаболизма»

Актуальность темы исследования

В настоящее время поиск низкомолекулярных регуляторов метаболизма является одной из актуальных задач биоинженерии. Направленные воздействия на отдельные биохимические реакции позволяют исследовать комплексные ответы метаболической сети на изменения в ее определенных узлах, что может применяться для решения различных задач в медицине, биотехнологии и системной биологии. Представители семейства дегидрогеназ 2-оксокислот функционируют в таких узловых точках метаболизма, имеющих ключевое значение для регуляции метаболизма в целом. Используя в качестве кофермента тиаминдифосфат -дифосфорилированную форму тиамина, или витамина B1, - данные ферменты в составе полиферментных комплексов связывают ключевые пути метаболизма углеводов и аминокислот. На сегодняшний день семейство включает в себя три хорошо охарактеризованных представителя, а именно пируватдегидрогеназу, 2-оксоглутаратдегидрогеназу и дегидрогеназа разветвленных 2-оксокислот [1], однако благодаря развитию методов высокопроизводительного секвенирования и масс-спектрометрии белков, появляется все больше данных также о существовании их различных изоферментов и изоформ. Так, были выявлены изоферменты 2-оксоглутаратдегидрогеназы, кодируемые генами OGDH, OGDHL и DHTKD1 [2], а также изоформы данного фермента, образующиеся в результате альтернативного сплайсинга [3] и различные посттрансляционные модификации всех дегидрогеназ 2-оксокислот [4, 5]. Ввиду ключевого положения дегидрогеназ 2-оксокислот в метаболизме, разные уровни экспрессии отдельных представителей семейства, равно как и присутствие их изоферментов и изоформ, в значительной степени определяет специфичность метаболизма отдельных клеток, тканей и даже целых организмов. В результате, при направленной регуляции определенных дегидрогеназ 2-оксокислот или их отдельных форм можно ожидать значительные эффекты на метаболизм изучаемых объектов, в том числе присущие лишь отдельным тканям и клеткам.

Для фармакологической регуляции комплексов дегидрогеназ 2-оксокислот в настоящее время используют структурные аналоги их коферментов, тиамина [6] или липоевой кислоты [7]. Однако такие соединения действуют независимо от субстратной специфичности комплексов. В то же время синтетические аналоги 2-оксокислот, у которых карбоксильная группа замещена фосфоновой или фосфиновой, предоставляют возможность селективно и эффективно ингибировать отдельных представителей семейства дегидрогеназ 2-оксокислот [6], а, возможно, и их отдельные изоферменты / изоформы. В отличие от генетических манипуляций, влияние на метаболизм in vivo с помощью таких субстратных аналогов может легко контролироваться по времени введения и является обратимым. Это позволяет проводить краткосрочные исследования,

не связанные с изменением экспрессии генов, а также комбинировать фармакологическую регуляцию дегидрогеназ 2-оксокислот с патологическими воздействиями и исследовать долгосрочные последствия такой регуляции.

Степень разработанности темы исследования

При постановке целей и задач данной работы учитывались существующие литературные данные, в основном описывающие механизм действия сукцинилфосфоната в качестве специфического ингибитора 2-оксоглутаратдегидрогеназы различных организмов, а также фосфиновых и фосфоновых аналогов пирувата как ингибиторов пируватдегидрогеназ растений и бактерий. Так, сукцинилфосфонат и его производные, эффективно ингибирующие 2-оксоглутаратдегидрогеназу животных [8], были исследованы в культурах клеток нейронов [9-13] и глиобластомы [14, 15], а также на разных животных [13, 16-18] и растительных [17, 19, 20] моделях, где показаны метаболические и физиологические ответы. Такие ответы, однако, сильно зависели от исходного состояния метаболической сети в тканях/клетках и могли отличаться, например, для клеточных линий с разной экспрессией 2-оксоглутаратдегидрогеназы, разных тканей животных, а также животных моделей различных патологий и контрольных животных. Таким образом, имеются данные о клеточной, тканевой и организменной специфичности регуляции дегидрогеназ 2-оксокислот на примере сукцинилфосфоната - ингибитора 2-оксоглутаратдегидрогеназы.

Ингибирование же пируватдегидрогеназы синтетическими аналогами пирувата приводило к снижению жизнеспособности растений и бактерий [6, 21], вследствие чего аналоги пирувата были предложены в качестве гербицидов и антибактериальных препаратов, однако исследований их действия на животных практически на проводилось. Использование же специфических ингибиторов дегидрогеназы разветвленных 2-оксокислот в литературе не описано.

При этом, за последние пятнадцать лет стали появляться все больше данных об изоформах и изоферментах дегидрогеназ 2-оксокислот и ассоциированных с ними в составе мультиферментных комплексов белков. В частности, белковые продукты идентифицированных в геномах животных генов ООБНЬ и ВНТК01 [2] могут отличаться от основного изофермента 2-оксоглутаратдегидрогеназы, кодируемого геном ООПН, по кинетическим свойствам, и как следствие, физиологической роли. Более того, специфичность регуляции таких изоферментов сукцинилфосфонатом или другими соединениями требует дальнейших исследований. Помимо изоферментов, в последнее время появляется все больше информации об альтернативных сплайсформах дегидрогеназ 2-оксокислот, в первую очередь гена ООПН [3], и их регуляторных пост-трансляционных модификациях, таких как фосфорилирование и ацилирование

пируватдегидрогеназы [4, 5]. Как и изоферменты 2-оксоглутаратдегидрогеназы, указанные сплайсформы и определенные ферменты, катализирующие пост-трансляционные модификации белков, могут также экспрессироваться в разной степени в различных тканях и/или клетках, что также осложняет регуляцию дегидрогеназ 2-оксокислот in vivo. Поэтому, на данный момент, исследований регуляторного действия низкомолекулярных регуляторов дегидрогеназ 2-оксокислот с учетом их изоферментов и изоформ не проводилось даже для сукцинилфосфоната.

Данная работа, таким образом, как расширяет список специфических регуляторов дегидрогеназ 2-оксокислот животных, так и более подробно характеризует уже существующие регуляторы, с учетом специфических изоферментов мишеней действия регуляторов. Исследование включает как эксперименты на изолированных ферментах, так и изучение действия регуляторов в живых системах (клетках и тканях животных), проводимое с учетом разной специфичности метаболизма экспериментальных объектов.

Цель и задачи работы

Цель данной работы заключается в разработке способов направленной фармакологической регуляции полиферментных комплексов дегидрогеназ 2-оксокислот разной субстратной специфичности у млекопитающих, с учетом клеточной и тканевой специфичности таковой регуляции. Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Разработать способы фракционирования тканей мозга, печени и сердца животных для получения препаратов, обогащенных полиферментными комплексами дегидрогеназ 2-оксокислот различной субстратной специфичности.

2. Определить синтетические аналоги дикарбоновых 2-оксокислот для специфического ингибирования 2-оксоглутаратдегидрогеназы и 2-оксоадипатдегидрогеназы тканей животных и охарактеризовать их действие в клетках и тканях.

3. Среди синтетических аналогов пирувата выявить наиболее эффективные ингибиторы пируватдегидрогеназы in vitro и охарактеризовать их действие in vivo.

4. Оценить возможность специфического ингибирования дегидрогеназы разветвленных 2-оксокислот синтетическими аналогами разветвленных 2-оксокислот.

5. Использовать специфические ингибиторы 2-оксоглутаратдегидрогеназы, 2-оксоадипатдегидрогеназы и пируватдегидрогеназы, для выявления последствий регуляции данных ферментов для физиологии клеток с разными типами метаболизма.

6. охарактеризовать краткосрочные и отложенные последствия действия специфических регуляторов дегидрогеназ 2-оксокислот на метаболизм экспериментальных животных с учетом его тканеспецифичности.

Объект и предмет исследования

Объектом данного исследования являются дегидрогеназы 2-оксокислот, функционирующие в ключевых точках метаболизма животных. Благодаря их положению на пересечении различных метаболических путей, регуляторные воздействия на данные ферменты приводят к глобальным метаболическим перестройкам. Предметом исследования являются такие направленные воздействия на дегидрогеназы 2-оксокислот с помощью их синтетических (фосфоновые аналоги 2-оксокислот) и природных (тиамин) регуляторов, с целью создания биологических объектов с измененными метаболическими характеристиками или коррекции патологий.

Научная новизна

В работе было изучено влияние новых фосфоновых аналогов 2-оксокислот, глутарилфосфоната и адипоилфосфоната на активности различных ферментов in vitro. Проведенное сравнительное исследование действия сукцинилфосфоната, глутарилфосфоната и адипоилфосфоната показало специфичность действия сукцинилфосфоната и адипоилфосфоната в качестве ингибиторов 2-оксоглутаратдегидрогеназы и ее изофермента, 2-оксоадипатдегидрогеназы, соответственно. Кроме того, фосфоновые и фосфиновые аналоги пирувата были впервые продемонстрированы в качестве ингибиторов пируватдегидрогеназы животных, поскольку предыдущие исследования с данными соединениями в основном касались пируватдегидрогеназ бактерий и растений. Впервые охарактеризовано действие фосфоновых аналогов разветвленных 2-оксокислот на дегидрогеназу разветвленных 2-оксокислот.

С помощью ингибиторов 2-оксоглутаратдегидрогеназы, 2-оксоадипатдегидрогеназы и пируватдегидрогеназы охарактеризованы метаболические последствия их ингибирования в клеточных культурах с разной экспрессией генов, кодирующих ферменты-мишени и ассоциированные с ними белки. Установлено, что ингибирование 2-оксоглутаратдегидрогеназы в клетках сопряжено с изменениями в окислении жирных кислот. В качестве общего индикатора ингибирования 2-оксоадипатдегидрогеназы выявлен глутарат; в зависимости от клеточной линии, при ингибировании изменяются также метаболизм сахаров и синтез NAD+ из триптофана либо метаболизм аминокислот, включая сахаропиновый путь деградации лизина. Показано, что эффекты ингибиторов дегидрогеназ 2-оксокислот на восстановительный потенциал клеток более выражены в клеточных линиях с более высокой экспрессией генов, кодирующих указанные дегидрогеназы.

Впервые показано, что ингибирование 2-оксоглутаратдегидрогеназы мозга приводит к изменениям редокс-метаболизма, а одним из индикаторов ингибирование 2-оксоадипатдегидрогеназы мозга является увеличение уровня триптофана. При ингибировании

пируватдегидрогеназы в мозге животных выявлено усиление деградации аминокислот и сопряженные изменения активности глутаминсинтазы, показана специфичность такой регуляции в разных анатомических отделах головного мозга животных. Также обнаружено, что однократная фармакологическая регуляция дегидрогеназ 2-оксокислот тиамином и фосфоновыми аналогами 2-оксокислот приводит к долгосрочным биохимических последствиям в нервной ткани.

Теоретическая и практическая значимость работы

Результаты работы имеют как теоретическую, так и практическую значимость для биоинженерии. Полученные данные исследований in vitro расширяют представления о специфичности действия сукцинилфосфоната в качестве ингибитора 2-оксоглутаратдегидрогеназы животных. Исследование новых фосфоновых аналогов, глутарилфосфоната и адипоилфосфоната, позволило предложить способы дискриминации активностей 2-оксоглутаратдегидрогеназы и ее изофермента, 2-оксоадипатдегидрогеназы. Фосфиновые и фосфоновые аналоги пирувата, которые ранее предлагалось использовать в качестве гербицидов и антибактериальных препаратов, были показаны в качестве эффективных и специфических ингибиторов пируватдегидрогеназы животных. Применение исследованных in vitro синтетических ингибиторов 2-оксоглутаратдегидрогеназы, 2-оксоадипатдегидрогеназы и пируватдегидрогеназы для регуляции данных ферментов клеточных линиях и в мозге животных расширяют список метаболических путей, в функционирование которых вовлечены указанные дегидрогеназы 2-оксокислот, и подтверждают уже имеющиеся данные.

Проведенная работа позволяет практическое использование фосфоновых и фосфиновых аналогов 2-оксокислот для инженерии метаболизма ввиду узловой роли в нем дегидрогеназ 2-оксокислот. В частности, такие соединения могут применяться в персонализированной медицине для диагностики раковых клеток с использованием тестов клеточной жизнеспособности, а также для терапевтических воздействий на особо чувствительные к данным регуляторам клетки. Кроме того, возможно использование синтетических аналогов 2-оксокислот для моделирования симптомов нейродегенеративных заболеваний. Решение таких задач с использованием методов системной биологии актуально для биоинженерии метаболических потоков в клетках. Так, возможно применение такой направленной регуляции метаболизма для усиления продукции определенных метаболитов для их биологического синтеза либо ее ослабление, например, для снижения симптомов наследственных дефектов метаболизма, при которых накапливается токсичный интермедиат.

В ходе выполнения данного исследования были также оптимизированы и разработаны методы анализа сложных биологических образцов с целью количественного определения

отдельных метаболитов в качестве индикаторов функции дегидрогеназ 2-оксокислот и метаболизма в целом. В частности, были усовершенствованы методы определения субстратов комплексов, NAD+ и 2-оксокислот, уровни которых могут также использоваться для диагностики различных метаболических нарушений.

Методология и методы исследования

Для определения эффективности и специфичности действия синтетических аналогов 2-оксокислот in vitro и клеточной и тканевой специфичности их эффектов in vivo использовались передовые для современного метода развития биоинженерии методы энзимологии, биохимии, аналитической химии и клеточной биологии, дополненные биоинформатическим анализом баз данных белковых последовательностей и экспрессии генов. Основные методы работы включают: частичную очистку комплексов дегидрогеназ 2-оксокислот с помощью селективного осаждения; определение активностей дегидрогеназ 2-оксокислот и ассоциированных ферментов и кинетический анализ их ингибирования фосфиновыми и фосфоновыми аналогами 2-оксокислот с помощью микропланшетных ридеров; получение экстрактов клеток и тканей для измерения уровней метаболитов, активностей ферментов и относительного содержания белков; определение метаболитов в экстрактах с помощью как высокопроизводительных (газовая хроматография, совмещенная с масс-спектрометрией, высокоэффективная жидкостная хроматография, ионообменная хроматография) так и энзиматических (спектрофотометрических и флуориметрических) методов; определение экспрессии целевых белков в тканях с помощью иммуноблоттинга; оценка восстановительного потенциала клеток; поиск последовательностей белков-гомологов целевого белка и их филогенетический анализ; экстракция данных по экспрессии генов интереса из транскриптомных (GEO, EMBL Expression Atlas) и протеомных (PaxDB, MOPED, EMBL Expression Atlas) баз данных и их обработка; статистический анализ экспериментальных данных с использованием имеющегося программного обеспечения (RStudio, GraphPad Prism).

Положения, выносимые на защиту

1. Среди исследованных аналогов 2-оксокислот, сукцинилфосфонат, адипоилфосфонат, ацетилфосфинат и метиловый эфир изобутирилфосфоната являются наиболее эффективными ингибиторами 2-оксоглутаратдегидрогеназы, 2-оксоадипатдегидрогеназы, пируватдегидрогеназы и дегидрогеназы разветвленных 2-оксокислот in vitro, соответственно.

2. В культурах клеток животных метаболическим индикатором ингибирования 2-оксоглутаратдегидрогеназы является падение уровня адипата, более выраженное в

клетках с высокой экспрессией гена OGDH (MCF-7). Маркерами ингибирования 2-оксоадипатдегидрогеназы являются падения уровней глутарата и глюкозы, зависящие от экспрессии в клетках гена DHTKD1. При ингибировании пируватдегидрогеназы наблюдается рост уровня пирувата и снижение уровней интермедиатов цикла Кребса и ассоциированных с ними аминокислот.

3. В мозге животных ингибирование 2-оксоглутаратдегидрогеназы приводит к изменению уровней NAD+, глутамата, цитруллина и редокс-потенциала глутатиона, ингибирование 2-оксоадипатдегидрогеназы вызывает изменение уровня триптофана.

4. При ингибировании пируватдегидрогеназы изменение содержания аминокислот и активности глутаминсинтазы зависят от анатомического отдела головного мозга.

Степень достоверности результатов

Достоверность результатов определяется применением статистического анализа данных, в том числе с использованием тестов Стьюдента, Манна-Уитни, однофакторного дисперсионного анализа с post hoc тестом Тьюки и теста Фридмана с post hoc тестом Данна, а также публикацией результатов в рецензируемых научных журналах.

Личный вклад автора в проведении исследования

Основные результаты работы получены самим автором. Личный вклад заключается в дизайне и проведении экспериментов; статистической обработке полученных результатов; анализе полученных результатов в свете известных из литературы данных; представлении результатов на научных конференциях и публикациях в рецензируемых научных журналах.

Проведенное исследование требовало кооперации с различными научными группами. Синтез фосфоновых и фосфиновых аналогов 2-оксокислот проводился сотрудниками Химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова. Хроматографическое разделение аминокислот для их количественного анализа осуществлялось сотрудниками отдела хроматографического анализа НИИ Физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского МГУ имени М.В. Ломоносова. Работа с экспериментальными животными проводилась совместно с сотрудниками биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова. Приготовление гомогенатов и экстрактов тканей животных проводилось совместно с другими сотрудниками отдела биокинетики НИИ Физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского МГУ имени М.В. Ломоносова. Эксперименты с клеточными культурами проводились при участии сотрудников Университетской клиники Лейпцигского университета (Германия), Медицинского Института Люблина (Польша) и Института молекулярной физиологии растений имени Макса Планка (Германия).

Публикации

По материалам диссертационной работы опубликованы 15 печатных работ в

рецензируемых журналах, индексируемых в базах данных Web of Science (в том числе, 5 статей

в журналах квартиля Q1), Scopus и RSCI1:

1) Ташлицкий В.Н., Артюхов А.В., Федорова Н.В., Суконников М.А., Ксенофонтов А.Л., Буник В.И., Баратова Л.А. Определение 2-оксокислот в экстрактах мозга крыс с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии // Биохимия. 2022. Т. 87, № 4. С. 497-507. IF WoS = 2.487 (0,69/0,2).

2) Graf A.V., Maslova M.V., Artiukhov A.V., Ksenofontov A.L., Aleshin V.A., Bunik V.I. Acute prenatal hypoxia in rats affects physiology and brain metabolism in the offspring, dependent on sex and gestational age // International Journal of Molecular Sciences. 2022. Vol. 23, № 5. P. 2579. IF WoS = 5.923 (0,94/0,15).

3) Artiukhov A.V., Graf A.V., Kazantsev A.V., Boyko A.I., Aleshin V.A., Ksenofontov A.L., Bunik V.I. Increasing inhibition of the rat brain 2-oxoglutarate dehydrogenase decreases glutathione redox state, elevating anxiety and perturbing stress adaptation // Pharmaceuticals. 2022. Vol. 15, № 2. P. 182. IF WoS = 5.863 (1,06/0,55).

4) Artiukhov A.V., Kolesanova E.F., Boyko A.I., Chashnikova A.A., Gnedoy S.N., Kaehne T., Ivanova D.A., Kolesnichenko A.V., Aleshin V.A., Bunik V.I. Preparation of affinity purified antibodies against s-glutaryllysine residues in proteins for investigation of glutarylated proteins in animal tissues // Biomolecules. 2021. Vol. 11, № 8. P. 1168. IF WoS = 4.879 (0,94/0,15).

5) Aleshin V.A., Artiukhov A.V., Kaehne T., Graf A.V., Bunik V.I. Daytime dependence of the activity of the rat brain pyruvate dehydrogenase corresponds to the mitochondrial sirtuin 3 level and acetylation of brain proteins, all regulated by thiamine administration decreasing phosphorylation of PDHA Ser293 // International Journal of Molecular Sciences. 2021. Vol. 22, № 15. P. 8006. IF WoS = 5.923 (1,12/0,15).

6) Aleshin V.A., Graf A.V., Artiukhov A.V., Boyko A.I., Ksenofontov A.L., Maslova M.V., Nogues I., di Salvo M.L., Bunik V.I. Physiological and biochemical markers of the sex-specific sensitivity to epileptogenic factors, delayed consequences of seizures and their response to vitamins B1 and B6 in a rat model // Pharmaceuticals. 2021. Vol. 14, № 8. P. 737. IF WoS = 5.863 (1,44/0,2).

7) Boyko A., Tsepkova P., Aleshin V., Artiukhov A., Mkrtchyan G., Ksenofontov A., Baratova L., Ryabov S., Graf A., Bunik V. Severe spinal cord injury in rats induces chronic changes in the spinal cord and cerebral cortex metabolism, adjusted by thiamine that improves locomotor

1 В скобках приведен объем публикации в условных печатных листах и вклад автора в условных печатных листах

performance // Frontiers in Molecular Neuroscience. 2021. Vol. 14. P. 620593. IF WoS = 5.639 (1,38/0,2).

8) Artiukhov A.V., Kazantsev A.V., Lukashev N.V., Bellinzoni M., Bunik V. Selective inhibition of 2-oxoglutarate and 2-oxoadipate dehydrogenases by the phosphonate analogs of their 2-oxo acid substrates // Frontiers in Chemistry. 2021. Vol. 8. P. 596187. IF WoS = 5.221 (1,06/0,65).

9) Artiukhov A.V., Pometun A.A., Zubanova S.A., Tishkov V.I., Bunik V.I. Advantages of formate dehydrogenase reaction for efficient NAD+ quantification in biological samples // Analytical Biochemistry. 2020. Vol. 603. P. 113797. IF WoS = 3.365 (0,31/0,15).

10) Бойко А.И., Артюхов А.В., Кэне Т., ди Сальво М.Л., Бонаккорси ди Патти М.К., Контестабиле Р., Трамонти А., Буник В.И. Идентифицированные в животных тканях изоформы 2-оксоадипатдегидрогеназы, кодируемой геном DHTKD1, не образуются при экспрессии DHTKD1 человека в бактериальной или дрожжевой системах // Биохимия. 2020. Т. 85, № 8. С. 1080-1090. IF WoS = 2.487 (0,63/0,1).

11) Artiukhov A.V., Grabarska A., Gumbarewicz E., Aleshin V.A., Kähne T., Obata T., Kazantsev A.V., Lukashev N.V., Stepulak A., Fernie A.R., Bunik V.I. Synthetic analogues of 2-oxo acids discriminate metabolic contribution of the 2-oxoglutarate and 2-oxoadipate dehydrogenases in mammalian cells and tissues // Scientific Reports. 2020. Vol. 10, № 1. P. 1886. IF WoS = 4.379 (1,38/0,7).

12) Меженская О.А., Алешин В.А., Кэне Т., Артюхов А.В., Буник В.И. Регуляция малатдегидрогеназ и глутаматдегидрогеназы мозга животных тиамином in vitro и in vivo // Биохимия. 2020. Т. 85, № 1. С. 34-48. IF WoS = 2.487 (0,81/0,1).

13) Артюхов А.В., Граф А.В., Буник В.И. Направленная регуляция полиферментных комплексов дегидрогеназ 2-оксокислот с помощью фосфоновых и фосфиновых аналогов 2-оксокислот // Биохимия. 2016. Т. 81, № 12. С. 1791-1816. IF WoS = 2.487 (1,50/0,6).

14) Aleshin V.A., Artiukhov A.V., Oppermann H., Kazantsev A.V., Lukashev N.V., Bunik V.I. Mitochondrial impairment may increase cellular NAD(P)H: resazurin oxidoreductase activity, perturbing the NAD(P)H-based viability assays // Cells. 2015. Vol. 4, № 3. P. 427-451. IF WoS = 6.600 (1,56/0,3).

15) Bunik V.I., Artiukhov A., Kazantsev A., Goncalves R., Daloso D., Oppermann H., Kulakovskaya E., Lukashev N., Fernie A., Brand M., Gaunitz F. Specific inhibition by synthetic analogs of pyruvate reveals that the pyruvate dehydrogenase reaction is essential for metabolism and viability of glioblastoma cells // Oncotarget. 2015. Vol. 6, № 37. P. 40036-40052. IF WoS = 5.008 (1,06/0,3).

Связь с государственными программами

Диссертационная работа выполнена при поддержке грантов РФФИ «Аспиранты» № 1934-90157 (Руководитель Буник-Фаренвальд В.И.), «Итал_т» № 18-54-7812 (Руководитель Буник-Фаренвальд В.И.), «Итал_т» № 20-54-7804 (Руководитель Граф А.В.) и грантов РНФ № 14-1500133 (Руководитель Буник-Фаренвальд В.И.), № 18-14-00116 (Руководитель Буник-Фаренвальд В.И.).

Апробация результатов

Работа была апробирована на заседании отдела биокинетики НИИ ФХБ имени А.Н. Белозерского МГУ 4 августа 2021 г. Результаты данной работы были представлены в виде доклада на ученом совете НИИ ФХБ имени А.Н. Белозерского МГУ в 2020 г., а также на различных российских и международных конференциях: Международная конференция для студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов», Москва, 2021, 2020 и 2018 г.; Международный симпозиум «Российское наследие Александра фон Гумбольдта», Москва, 2019 г; 34th European Congress of Neuropsychopharmacology, Копенгаген (Дания), 2019 г.; I Студенческий биохимический форум МГУ, Москва, 2018 г.; XIX Tetrahedron Symposium, Рива дель Гарда (Италия), 2018 г.; Keystone Symposia Conference: Rare and Undiagnosed Diseases: Discovery and Models of Precision Therapy, Бостон (США), 2017 г.; XIII Human Proteome Organization World Congress, Мадрид (Испания), 2014 г.; Студенческая конференция ФББ МГУ, Москва, 2014 и 2015 г.

Структура и объем работы

Работа состоит из введения, обзора литературы, описания экспериментальной части, результатов и их обсуждения, заключения, основных выводов и результатов, списка публикаций и списка цитируемой литературы, содержащего 438 ссылок, и дополнительных материалов. Работа изложена на 170 страницах текста, содержит 7 таблиц и 33 рисунка.

2. Обзор литературы

2.1. Дегидрогеназы 2-оксокислот2

2.1.1. Общая характеристика комплексов дегидрогеназ 2-оксокислот и их основные представители

Дегидрогеназы 2-оксокислот являются одними из важнейших звеньев метаболизма, сопрягающими деградацию Сахаров и аминокислот в подавляющем большинстве живых организмов. Функционируя в ключевых точках аэробного метаболизма в виде полиферментных комплексов, данные ферменты катализируют реакции окислительного декарбоксилирования 2-оксокислот и являются важнейшими мишенями природных и синтетических систем регуляции, обеспечивающими тонкую настройку всей метаболической сети организма.

Комплексы дегидрогеназ 2-оксокислот имеют молекулярную массу 4-10 МДа [22] и играют роль макромолекулярных машин, в которых ассоциация субъединиц служит для колокализации ферментов, увеличивая эффективность переноса интермедиатов и общую регуляцию блока реакций. Все охарактеризованные представители комплексов занимают ключевые позиции в центральном метаболизме, сопрягая цикл трикарбоновых кислот с гликолизом и деградацией аминокислот.

На сегодняшний день семейство комплексов дегидрогеназ 2-оксокислот включает три основных представителя, имеющих схожее строение и механизм катализируемых реакций, но отличающихся по субстратной специфичности и, как следствие, по физиологической роли (Рис. 1, Табл. 1). Так, существенную роль в цикле Кребса играет 2-оксоглутаратдегидрогеназа (ОГДГ) в составе 2-оксоглутаратдегидрогеназного комплекса (ОГДК), катализирующего необратимую стадию всего процесса - окислительное декарбоксилирование 2-оксоглутарата до сукцинил-СоА. Лимитируя поток метаболитов в цикле Кребса, ОГДК принимает участие и в распаде кетогенных аминокислот, протекающем через данный цикл. Не менее важной является и пируватдегидрогеназа (ПДГ), ключевой компонент пируватдегидрогеназного комплекса (ПДГК), который катализирует окислительное декарбоксилирование пирувата до ацетил-СоА и, таким образом, связывает гликолиз, распад аминокислот группы пирувата и цикл Кребса. Менее изученным представителем семейства является дегидрогеназа разветвленных 2-оксокислот (ДГРК), формирующая комплекс дегидрогеназы разветвленных 2-оксокислот (КДГРК). КДГРК катализирует схожие с ОГДК и КДГРК реакции окислительного декарбоксилирования, в

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Артюхов Артем Викторович, 2022 год

Фермент Источник -

субстрата С1г1 о, 1 мМ СФ 0,1 мМ ГФ 0,1 мМ АФ

0,01 мМ 2-оксоадипат Обогащенная фракция из 0,96 ± 0,10 0,59 ± 0,04 0 0,09 ± 0,01

ОАДК / 0,2 мМ 2-оксоглутарат печени крысы 14,9 ± 0,4 2,5 ± 0,2 0,2 ± 0,2 12,1 ± 0,5

ОГДК 0,01 мМ 2-оксоадипат Обогащенная фракция из 1,23 ± 0,04 0 0 0,87 ± 0,36

0,2 мМ 2-оксоглутарат сердца крысы 123 ± 1 50 ± 3 52 ± 1 119 ± 2

ПДГК 0,2 мМ пируват Обогащенная фракция из сердца крысы 163 ± 4 148 ± 2 144 ± 1 156 ± 7

КДГРК 0,2 мМ 3-метил-2-оксовалерат Обогащенная фракция из печени крысы 1,81 ± 0,05 1,70 ± 0,06 1,75 ± 0,04 1,93 ± 0,11

ГДГ 0,2 мМ 2-оксоглутарат Очищенный фермент из печени быка 81,9 ± 1,3 74,8 ± 0,5 69,3 ± 0,8 73,7 ± 3,1

Гомогенат печени крысы 27,3 ± 0,4 28,4 ± 0,3 28,3 ± 0,0 26,3 ± 0,4

МДГ 0,2 мМ Гомогенат печени крысы 345 ± 11 315 ± 22 369 ± 14 379 ± 11

оксалоацетат Гомогенат сердца крысы 471 ± 5 500 ± 8 518 ± 7 517 ± 7

ЛДГ 0,2 мМ лактат Очищенный фермент из мышц кролика 219 ± 1 217 ± 2 215 ± 8 211 ± 5

ПК 0,2 мМ фосфо-енолпируват Очищенный фермент из мышц кролика 27,3 ± 1,0 24,1 ± 0,3 25,6 ± 0,8 26,9 ± 1,4

ГОТ 2 мМ 2-оксоглутарат Гомогенат печени крысы 16,7 ± 0,7 19,6 ± 0,2 20,3 ± 0,2 21,4 ± 0,4

Гомогенат сердца крысы 30,4 ± 0,6 31,7 ± 1,2 28,7 ± 1,0 30,9 ± 0,3

ГПТ Гомогенат печени крысы 1,83 ± 0,06 1,74 ± 0,41 1,49 ± 0,23 1,91 ± 0,10

ИЦДГ 2 мМ изоцитрат Гомогенат печени крысы 5,30 ± 0,11 4,31 ± 0,06 5,13 ± 0,03 5,36 ± 0,03

Гомогенат сердца крысы 1,20 ± 0,02 1,00 ± 0,01 1,29 ± 0,11 1,28 ± 0,04

МФ 2 мМ малат Гомогенат печени крысы 0,085 ± 0,002 0,067 ± 0,002 0,078 ± 0,005 0,102 ± 0,002

4.4. Ингибирование ПДГК и КДГРК животных синтетическими аналогами пирувата и разветвленных 2-оксокислот8

4.4.1. Ингибирование активности ПДГК фосфоновыми и фосфиновыми аналогами пирувата

В отличие от сравнительного действия СФ, ГФ и АФ на ОГДК и ОАДК животных, кинетика ингибирования ПДГК фосфоновыми и фосфиновыми аналогами пирувата уже подробным образом была изучена на растительных и бактериальных ферментах. Поэтому сравнительное исследование ингибирования ПДГК животных в данной работе проводилось лишь в условиях насыщающей концентрации пирувата (2 мМ; KPyrm ~ 0,02-0,1 мМ для ПДГК млекопитающих [323-325]). При этом, основное исследование проводилось на препарате, обогащенном ПДГК, при этом практически не содержащем активности ОГДК, из мозга крысы.

В отличие от ингибирования ОГДК / ОАДК СФ, ГФ и АФ при насыщающих концентрациях 2-оксосубстратов (Рис. S2), преинкубация препарата ПДГК с аналогами пирувата значительно усиливает ингибирующие эффекты последних (Рис. 12A). Такое усиление ингибирования наиболее выражено для АцФН, что позволяет сделать вывод о частичной необратимости ингибирования ПДГК данным аналогом. Так, при экспоненциальной аппроксимации зависимости % ингибирования активности 0,15 мкМ АцФН от времени преинкубации константа инактивации составляет 0,35 мин-1. В связи с этим, сравнительные эффекты аналогов пирувата на ПДГК были проанализированы после 5 мин преинкубации (Рис. 12B). В указанных условиях АцФН был наиболее сильным ингибитором (IC50 = 0,087 ± 0,017 мкМ, что для конкурентного ингибирования соответствует Ki = 0,86 ± 0,17 нМ). АцФМеН, отличающийся от АцФН метильным заместителем на фосфиновой группе, являлся на два порядка более слабым ингибитором ПДГК (Ki = 0,14 ± 0,03 мкМ), нежели АцФН. Тем не менее, ингибирующая способность АцФМеН оказывалась выше, чем у фосфоновых аналогов пирувата. Так, в случае АцФ не удавалось достичь даже 50% ингибирования ПДГК, однако его моноэтерифицированное производное, АцФМе, уже было эффективным ингибитором (Ki = 1,0 ± 0,3 мкМ) (Рис. 12B). Полностью этерифицированное производное АцФ (АцФМе2) совсем не проявляло ингибирующих свойств в исследуемых условиях, наоборот, увеличивая активность ПДГК на ~20%. Возможно, такое действие связано с аллостерической активацией комплексов дегидрогеназ 2-оксокислот субстратами и их фосфоновыми аналогами, рассмотренную выше на примере 2-оксоглутарат- и 2-оксоадипатдегидрогеназ. Стабильный активирующий эффект

8 При подготовке данного раздела диссертации использованы следующие публикации, выполненные автором лично или в соавторстве, в которых, согласно Положению о присуждении ученых степеней в МГУ, отражены основные результаты, положения и выводы исследования: Bunik VI, Artiukhov A, Kazantsev A, Goncalves R, Daloso D, Oppermann H, Kulakovskaya E, Lukashev N, Fernie A, Brand M & Gaunitz F (2015) Specific inhibition by synthetic analogs of pyruvate reveals that the pyruvate dehydrogenase reaction is essential for metabolism and viability of glioblastoma cells. Oncotarget, 6(37):40036-52 (вклад 0,6 / 1,98 УПЛ).

диметилового фосфонового аналога пирувата может отражать его преимущественное действие по аллостерическому механизму, тогда как связывание по каталитическому центру требует наличия заряженной группы.

Рис. 12 Ингибирующие эффекты фосфиновых и фосфоновых аналогов пирувата на активности изолированных ПДГК, ОГДК и КДГРК. Реакции начинались добавлением 2-оксосубстрата в насыщающей концентрации (2 мМ пирувата, 2 мМ 2-оксоглутарата, 0.5 мМ 2-оксоизовалерата, 0.5 мМ 2-оксо-3-метилвалерата) к преинкубированному препарату фермента с аналогами в указанных концентрациях в реакционной среде без 2-оксосубстрата. (A) Эффект времени преинкубации на ингибирующий эффект 0,15 мкМ АцФН на активность ПДГК из сердца крысы. (B) Эффекты аналогов пирувата на активность ПДГК из мозга крысы после 5 мин преинкубации. (C) Эффекты аналогов на активность ОГДК из мозга крысы после 5 мин преинкубации. (D) Эффекты аналогов на активность КДГРК из печени крысы после 5 мин преинкубации (АцФН) или 1 мин преинкубации (АцФМе, АцФМе2); в случае АцФН активность измерялась с 2-оксоизовалератом в качестве 2-оксосубстрата, в случае АцФМе и АцФМе2 - с 2-оксо-3-метилвалератом. Экспериментальные данные аппроксимированы экспонентой (y=yo*e-kx, A) или гиперболой (y=100/(1+x/IC5o), B-D). Значения Ki, посчитанные из полученных при аппроксимации значений IC50, показаны рядом с графиками; в случаях отсутствия выраженного ингибирования (не достигается снижения активности на 50%) значения выделены курсивом.

Используемые фосфоновые и фосфиновые аналоги пирувата не ингибировали активности ОГДК и КДГРК при насыщающих концентрациях их 2-оксосубстратов в тех концентрациях, при которых наблюдалось эффективное ингибирование ПДГК. Даже при преинкубации с 0,2 мМ АцФН его эффект на активность ОГДК с 2 мМ 2-оксоглутаратом не превышал 30% (Рис. 12С). Тем не менее, АцФН все же полностью ингибировал КДГРК в реакции с 2-оксоизовалератом, хотя и соответствующее значение Ki (1,8 ± 0,7 мкМ) оказывалось на порядки выше, чем для ПДГК (Рис 12D).

4.4.2. Ингибирование активностей КДГРК, ПДГК и ОГДК фосфоновыми аналогами разветвленных 2-оксокислот

В качестве специфических ингибиторов КДГРК можно использовать фосфоновые аналоги его 2-оксокислотных субстратов с разветвленной цепью (Рис. 4C). В данном случае использовались производные трех соединений: изобутирилфосфоната (IBP) - фосфонового аналога 2-оксоизовалерата, изовалерилфосфоната (IVP) - аналога 2-оксоизокапроата и 2-метилбутирилфосфоната (2-MBP) - аналога 2-оксо-3-метилвалерата. Как и в случае производных ацетилфосфоната, наибольшего ингибирования удается достичь при использовании монометиловых эфиров фосфонатов, однако лишь в ненасыщающих концентрациях 2-оксосубстрата (Рис. 13A). Так, при 0,05 мМ концентрации 2-оксоизовалерата наиболее эффективным ингибитором оказывается метиловый эфир 2-метилбутирилфосфоната (IBPMe, Ki = 70 ± 9 мкМ), для которого хотя и не достигается 50% ингибирования даже при 200 мкМ концентрации аналога, заметно наибольшее снижение активности среди остальных 2-оксофосфонатов.

Ингибирование КДГРК деэтерифицированными и полностью этерифицированными производными разветвленных фосфонатов выражено значительно слабее или вовсе отсутствует (Рис. 13А). При 0,5 мМ концентрации 2-оксоизовалерата значимой инактивации КДГРК монометиловыми эфирами соответствующих фосфонатов в тех же условиях не наблюдается (Рис. 13B). Исследуемые соединения не влияли на активности ПДГК (Рис. 13С), однако значительно снижали активность ОГДК (Рис. 13D), что делает соединения, такие как IBPMe, слабыми и неспецифическими ингибиторами КДГРК и препятствует их практическому использованию в in vivo исследованиях.

Рис. 13. Ингибирующие эффекты фосфоновых аналогов разветвленных 2-оксокислот на активности изолированных КДГРК, ПДГК и ОГДК. Реакции начинались добавлением 2-оксосубстрата в насыщающей концентрации (0.5 и 0,05 мМ 2-оксоизовалерата, 2 мМ пирувата, 2 мМ 2-оксоглутарата) к преинкубированному препарату фермента с аналогами в указанных концентрациях в реакционной среде без 2-оксосубстрата в течение 5 мин. (А, В). Эффекты аналогов на активность КДГРК из печени крысы при 0,5 (А) и 0,05 мМ (В) 2-оксоизовалерата. (С) Эффекты аналогов на активность ПДГК из мозга крысы. (Б) Эффекты аналогов на активность ОГДК из мозга крысы. Экспериментальные данные аппроксимированы гиперболой (у=100/( 1+Х/1С50)). Значения К1, посчитанные из полученных при аппроксимации значений 1С50, показаны рядом с графиками.

4.5. Эффекты ингибирования дегидрогеназ 2-оксокислот в клеточных линиях зависят от специфики клеточного метаболизма9

4.5.1. Эффекты ингибиторов ОГДК и ОАДК на клеточный метаболизм

В отличие от эффектов in vitro, действие регуляторов дегидрогеназ 2-оксокислот на биохимические показатели клеток и тканей (in vivo) будет определяться значительно большим количеством факторов, формирующих особенности конкретной метаболической сети. Одними из основных из таковых факторов являются гетерогенность экспрессии ферментов-мишеней (дегидрогеназ 2-оксокислот) и непосредственно ассоциированных с ними компонентов соответствующих дегидрогеназных комплексов.

В частности, влияние фосфоновых ингибиторов ОГДК и ОАДК (СФ, ГФ, АФ) и вклад указанных дегидрогеназ в метаболизм был исследован на клеточных линиях, отличающихся по экспрессии ОАДГ (DHTKD1). Выбранные для исследования клеточные линии глиомы крысы C6 и аденокарциномы молочной железы человека MCF-7 аналогичны тканям крысы с низкой и высокой экспрессией гена DHTKD1, соответственно (Рис. 14А). Значительные отличия в экспрессии DHTKD1 в двух линиях, приводящие к разным соотношениям в них DLST / DHTKD1 при схожих соотношениях DLST / OGDH(L) (Рис. 14B), сопровождаются различиями в клеточных метаболомах (Рис. 14C,D). В этой связи наиболее интересны метаболиты, связанные с 2-оксоадипатдегидрогеназной реакцией. Так, уровни лизина и триптофана, катаболизм которых протекает через данную реакцию, выше в линии MCF-7 по сравнению с C6 (Рис. 14C). Также в клетках MCF-7 наблюдается и устойчивая детекция сахаропина и 2-оксоглутарата, в отличие от C6 (Рис. 14D). В то же время уровень 2-аминоадипата выше в клетках линии C6, по сравнению с MCF-7 (Рис. 14C), а метаболит пути реутилизации NAD, никотинат, устойчиво определяется в клетках линии C6, но не детектируется в MCF-7 (Рис. 14D).

Наблюдаемые различия в представленности 2-оксоадипат-ассоциированных метаболитов в клеточных линиях с низкой и высокой экспрессией DHTKD1 сопряжены с различиями в метаболизме сахаров. По сравнению с C6, клетки линии MCF-7 также имеют более высокие уровни фосфорилированных сахаров и их других производных и низкие уровни нефосфорилированных сахаров (Рис. 14C,D). Помимо этого, клетки линии MCF-7

9 При подготовке данного раздела диссертации использованы следующие публикации, выполненные автором лично или в соавторстве, в которых, согласно Положению о присуждении ученых степеней в МГУ, отражены основные результаты, положения и выводы исследования: Artiukhov AV, Grabarska A, Gumbarewicz E, Aleshin VA, Kähne T, Obata T, Kazantsev AV, Lukashev NV, Stepulak A, Fernie AR & Bunik VI (2020) Synthetic analogues of 2-oxo acids discriminate metabolic contribution of the 2-oxoglutarate and 2-oxoadipate dehydrogenases in mammalian cells and tissues. Scientific Reports, 10(1):1886 (вклад 0,7 / 1,38 УПЛ). Aleshin VA, Artiukhov AV, Oppermann H, Kazantsev AV, Lukashev NV & Bunik VI (2015) Mitochondrial impairment may increase cellular NAD(P)H: resazurin oxidoreductase activity, perturbing the NAD(P)H-based viability assays. Cells, 4(3):427-51 (вклад 0,5 / 1,56 УПЛ). Bunik VI, Artiukhov A, Kazantsev A, Goncalves R, Daloso D, Oppermann H, Kulakovskaya E, Lukashev N, Fernie A, Brand M & Gaunitz F (2015) Specific inhibition by synthetic analogs of pyruvate reveals that the pyruvate dehydrogenase reaction is essential for metabolism and viability of glioblastoma cells. Oncotarget, 6(37):40036-52 (вклад 0,6 / 1,98 УПЛ).

демонстрируют более высокие уровни разветвленных аминокислот, пролина, серина и орнитина (Рис. 14C,D). Метаболиты, уровни которых значительно ниже в клетках MCF-7 включают гуанидин, полиамины, глутарат и адипат.

Для характеристики метаболических изменений, индуцируемых в клетках C6 и MCF-7 ингибиторами ОАДК и ОГДК, клетки инкубировались с умеренными (0,5 мМ) концентрациями СФ, ГФ и АФ в течение 5 ч в «минимальной» среде (глюкоза + соли). Такие условия минимизируют способность клеток компенсировать ингибирование ферментативных активностей переупорядочиванием ассоциированных метаболических процессов. Наблюдаемые метаболические изменения в клетках, обработанных фосфонатами, в первую очередь показывают разницу в действии СФ и ГФ / АФ (Рис. 15A,B), что соответствует преимущественному действию СФ на ОГДК in vitro, а АФ - на ОАДК (см. п.п. 4.3.2-4.3.3). ГФ же, несмотря на ингибирование активностей обоих комплексов in vitro, in vivo вызывает метаболические изменения ближе к таковым для АФ. Ввиду конкурентной природы действия 2-оксофосфонатов, гораздо более низкая концентрация 2-оксоадипата, по сравнению с 2-оксоглутаратом, в клетках и тканях животных [108], селективность действия ГФ и АФ в отношении ОАДК может усиливаться in vivo.

Указанные на Рис. 15A разницы в расстояниях между кластерами метаболических изменений для СФ и ГФ+АФ против ГФ и АФ значительно выше для клеток линии C6 (31,21 против 18,15), чем для MCF-7 (23,95 против 19,04). Более того, в клетках C6 специфическое действие СФ по сравнению с ГФ+АФ более выражено (31,21), чем в MCF-7 (23,95). В то же время, расстояния между кластерами ГФ и АФ в клетках C6 и MCF-7 схожи (18,15 и 19,04). Таким образом, при одинаковых экспериментальных условиях, различающиеся по метаболизму клетки С6 и MCF-7 демонстрируют и различающиеся ответы на инкубацию с 2-оксофосфонатами. Более выраженные эффекты СФ наблюдаются при более низкой экспрессии OGDH(L), наблюдаемой в клетках линии C6 (Рис. 15А).

Рис. 14. Различия в клеточных метаболомах при разной экспрессии компонентов ОГДК и ОАДК.

(А) Относительные уровни мРНК генов, кодирующих компоненты ОГДК и ОАДК в клеточных линиях С6 и ЫСР-7. Показанные представленности транскриптов были усреднены из >8 независимых экспериментов для каждой из клеточных линий. Б/О показывает соотношения между экспрессией гена ОИТКБ1 и суммарной экспрессией ООБИ + ООБИЬ. (В) Отношения уровней мРНК генов, кодирующих компоненты Е2 (Ш5Т) и Е1 (БИТКЫ, ООБИ, ООИШ) ОГДК и ОАДК. (С) Относительное содержание метаболитов в клеточной линии ЫСР-7 в сравнении с линией С6. Звездочками показаны достоверные отличия между линиями согласно тесту Стьюдента. Экспериментальные группы и метаболиты кластеризованы методом WPGMA с использованием манхэттеновского расстояния. п внизу показывает число независимых экспериментов для каждой линии. (Б) Метаболиты, надежно квантифицируемые только в одной из клеточных линий, указанные «+» для той линии, в которой они детектируются, и «-» в другой.

Рис. 15. Эффекты СФ, ГФ и АФ на клеточные метаболомы. Метаболические пертурбации в клетках линий C6 (А) и MCF-7 ф) после 5 ч инкубации в минимальной среде с сукцинил- (SP), глутарил- (GP) и адипоилфосфонатом (AP) в концентрации 0,5 мМ указаны как log2 от изменений относительно необработанных клеток того же посева. Кластеризация экспериментальных групп и метаболитов и статистический анализ проводились так же, как и на Рис. 14С Интермедиаты метаболических путей, упоминаемых в тексте, подчеркнуты.

Изменения содержания конкретных метаболитов, устойчиво определяемых в обеих линиях клеток, под действием фосфоновых аналогов дикарбоновых 2-оксокислот также значительно отличались в двух типах клеток, хотя наблюдалось и небольшое число схожих

эффектов. Как было показано ранее (Рис. 14C,D), исследуемые клеточные линии демонстрируют специфические различия в метаболических путях, включающих никотинат, детектируемый лишь в линии C6, либо сахаропин, детектируемый лишь в линии MCF-7. Исходя из статистической значимости при использовании более строгого статистического анализа, изменения выбранных индикаторов, а именно глутарата, адипата, глюкозы и у-аминобутирата, клетки линии C6, в целом, более подвержены действию фосфонатов (Рис. 16). Снижение адипата и глутарата наблюдается в обоих клеточных линиях, однако в случае адипата ингибиторы, связывающиеся с ОГДК, СФ (в MCF-7) и ГФ (в C6), оказывают больший эффект (Рис. 16A,B), при этом амплитуда СФ-индуцируемого эффекта в MCF-7 превышает таковую для ГФ-индуцируемого эффекта в C6 (Рис. 16A,B). Таким образом, именно ОГДК, вероятно, ответственна за снижение адипата, более выраженного в клетках с высокой экспрессией его компонентов, что хорошо согласуется с результатами предыдущими исследований о том, что ОГДК регулирует вход в митохондрии жирных кислот [326], интенсивность Р-окисления которых отрицательно коррелирует с уровнями адипата [327].

Снижение же глутарата, в отличие от адипата, более достоверно в случае АФ, при этом больший эффект достигается в клетках C6, по сравнению с MCF-7 (Рис. 16C,D). Ввиду того, что глутарат может образовываться из глутарил-CoA, продукта ОАДГ реакции, неферментативным гидролизом или реакцией трансацилирования с другими производными ацил-CoA [328], падение генерации глутарил-CoA путем ингибирования ОАДГ может снижать уровень глутарата. Это подтверждается более сильным эффектом снижения глутарата при инкубации клеток с АФ, по сравнению с СФ и ГФ. Поскольку амплитуда снижения глутарата должна быть обратно пропорциональна содержанию ОАДК в клетке, низкая экспрессия DHTKD1 приводит к более выраженному эффекту АФ на уровень глутарата именно в клетках линии C6. Помимо глутарата, АФ также вызывает в клетках C6 наиболее значительное снижение уровня глюкозы, по сравнению с СФ и ГФ (Рис. 16E). Обработка клеток C6 АФ также вызывает значимое снижение уровня у-аминобутирата (Рис. 16G), который, благодаря своей функции в качестве нейромедиатора, ассоциирован с нарушенным метаболизмом глюкозы [329-333]. При этом, уровни глюкозы и у-аминобутирата в клетках MCF-7 значимо не меняются (Рис. 16F,H), что соответствует менее выраженному снижению в них уровня глутарата (Рис. 16D). И, хотя, глюкоза и у-аминобутират оказываются в одном кластере как в клетках C6, но и в MCF-7, где данные метаболиты значимо не меняются при действии аналогов, лишь в C6 данный кластер является частью большего кластера содержащего глутарат и адипат (Рис. 15 А).

С6

Ad i pate

ю

1

a

0.1 0.01 0.001 0.0001

0.1

£ 0.01

U) ®

f 0.001 га

£ 0.0001

Ctrl SP GP АР

Factor significance: p = 0.001

Glutarate

p=0.004

0.00001

Ctrl SP GP AP

Factor significance: p = 0.001

100 10 1

fd <u

0.1

0.01

G

0.1

Ü 0.01 Q

Ш

£ 0.001

ra

£ 0.0001 0.00001

Ctrl SP GP AP

Factor significance: p = 0.006

4-Aminobutyrate

P-0.02CI

Ctrl SP GP AP

Factor significance: p =0.012

Tryptophan

0.1

0.01

Ф

<D 0.001 0.

0.0001

в

MCF-7

Adipate

10

£ 1

13»

| 0.1

я 0.01 a

0.001 0.0001

D

0.1

jj, 0.01 □J

Ф

f 0.001

III

tt. 0.0001 0.00001

p=n.pj;

Ctrl SP GP AP

Factor significance: p = 0.044

Glutarate

Ctrl SP GP AP

Factor significance: p = 0.123

Glucose

100 10 1

ra 9

Q- 0.1

0.01

H

0.1

£ 0.01 □1

'3

f 0.001

л

£ 0.0001 0.00001

Ctrl SP GP AP

Factor significance: p = 0.372

4-Aminobutyrate

J

Ctrl SP GP AP

Factor significance: p = 0.445

Tryptophan

0.1

Ctrl SP GP AP

Factor significance; p = 0.260

3 0.01

Ф

0) 0.001 Q.

0.0001

p=0.086

Ctrl SP GP AP

Factor significance; p = 0.093

Рис. 16. Сравнение эффектов СФ, ГФ и АФ на уровни адипата (A, B), глутарата (C, D), глюкозы (E, F), у-аминобутирата (G, H) и триптофана (I, J) в клеточных линиях C6 (A, C, E, G, I) и MCF-7 (B, D,

F, H, J). p-value для значимости факторов обработки веществами согласно тесту Фридмана указаны как точные значения под всеми графиками;, а для отличий между отдельными группами согласно post hoc тесту Данна - внутри графиков. Линии связывают значения, полученные для одного и того же посева клеток. Средние значения указаны горизонтальными чертами.

I

Помимо упомянутой кластеризации, выявляющей связь глюкозы, у-аминобутирата и глутарата в клетках C6, заслуживает внимания кластеризация C6-специфического метаболита никотината. Как показано на Рис. 15 А, индуцируемые 2-оксофосфонатами изменения уровня никотината также ассоциированы с глюкозой и у-аминобутиратом. Соответствующий кластер включает также и сахара, в частности мальтозу и фруктозу. Все метаболиты этого кластера демонстрируют выраженное снижение при действии ГФ и АФ, хотя эффекты АФ более достоверны, и не подвержены действию СФ. Близкое же расположение кластера, включающего изменения никотината, глюкозы и у-аминобутирата, и кластера, в состав которого входят глутарат и адипат, в разной степени снижающиеся при действии всех трех фосфонатов, также интересно с точки зрения известных взаимодействий никотината и ОАДГ с метаболическими путями глюкозы и липидов (см. п. 2.1.4.1). Специфическое же действие СФ в клетках C6 заключается в значимом увеличении аланина и аспартата, ассоциированных с циклом Кребса [9, 14, 256].

В клетках линии MCF-7, специфические эффекты СФ в основном связаны со снижением производных сахаров, в частности, ангидроглюкозы, глюкозы-6-фосфата, инозитол-1-фосфата и мальтозы (Рис. 1 5B), что может свидетельствовать о возможной компенсации ингибирования ОГДК за счет перестройки метаболизма углеводов. ГФ и АФ же значимо снижают уровни аминокислот: метионина, разветвленных аминокислот, фенилаланина и триптофана, - однако эффекты ГФ более достоверны (Рис. 15B, 16J). В клетках линии C6 эффекты ГФ и АФ на уровни аминокислот менее выражены (Рис. 15А, 16I).

Таким образом, общие и специфические изменения клеточного метаболома, наблюдаемые после обработки клеток с разной экспрессией DHTKD1 2-оксофосфонатами, выявляют специфические эффекты СФ и АФ, ингибирующие ОГДК и ОАДК, соответственно (см. п.п. 4.3.24.3.3). В клетках линии C6 с низкой экспрессией DHTKD1 значимое падение функции ОАДК проявляется в наиболее значительном снижении уровня глутарата, ассоциированным с нарушенным гомеостазом глюкозы, а ингибирование ОГДК вызывает увеличение уровней аминокислот, ассоциированных с циклом Кребса. В клетках линии MCF-7, где все три изофермента ОГДГ, экспрессируются на более высоком уровне, чем в C6, наиболее выражено снижение адипата под действием СФ, сопряженное с компенсацией метаболизма за счет производных глюкозы, а фосфонаты ингибирующие ОАДК вызывают перестройку аминокислотного метаболизма.

Одним из интегральных индикаторов клеточного метаболизма, а также их пролиферации, является так называемый восстановительный потенциал, который может анализироваться с помощью NAD(P)-зависимого восстановления искусственных красителей, таких как 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолий (МТТ). Изменения восстановительного потенциала

клеток линий C6 и MCF-7 при их инкубации с СФ, ГФ или АФ оценивались при двух типах условий: после 5 ч инкубации с аналогами в минимальной среде и после 96 ч инкубации в полной среде (DMEM). Первый тип условий соответствует тем, при которых оценивались изменения метаболических профилей (Рис. 15, 16), в то время как второй используется для анализа клеточной пролиферации. При этом, в отличие от действия 2-оксофосфонатов на клеточный метаболизм, исследовались концентрационные зависимости их эффектов восстановительный потенциал, которые варьировали в зависимости от структуры 2-оксофосфонатов (Рис. 17).

Рис. 17. Сравнение эффектов СФ, ГФ и АФ на клеточную жизнеспособность. Зависимости NAD(P)H:MTT-оксидоредуктазной активности клеточных линий C6 (А, C) и MCF-7 (B, D) после 5 ч инкубации с СФ, ГФ или АФ в минимальной среде (А, B) или после 96 ч инкубации в среде оптимального роста (C, D). Данные представлены как среднее ± SEM.

Сильное концентрационно-зависимое увеличение активности клеточной NAD(P)H:MTT редуктазы после 5 ч инкубации со всеми 2-оксофосфонатами более выражено в клетках линии MCF-7 (в три раза), чем в клетках C6 (в 2 раза) (Рис. 17A,B). Вдобавок к более высокой амплитуде, эффект повышения восстановительного потенциала в клетках линии MCF-7 заметен при более низких концентрациях фосфонатов (начиная с 0,2 мМ, пунктирная линия на Рис. 17B), по сравнению с C6 (лишь при 10 мМ, Рис. 17A). В результате, инкубация с фосфоновыми аналогами в концентрации 5 мМ не меняет жизнеспособность клеток линии C6, оказывая при этом максимальный эффект на клетки линии MCF-7.

Более сильные эффекты 2-оксофосфонатов на клеточную линию MCF-7 по сравнению с C6 наблюдаются и после их 96 ч инкубации, в целом приводящей к значительному снижению клеточной жизнеспособности под действием всех трех ингибиторов (Рис. 17C,D). Однако в этих условиях становится очевидным, что при действии СФ более выражен эффект локального увеличения клеточной NAD(P)H:MTT-редуктазной активности, чем при действии ГФ и АФ. В клетках MCF-7 СФ также вызывал наиболее сильный эффект снижения адипата (Рис. 16B), свидетельствуя об увеличении Р-окисления жирных кислот. Следовательно, такое увеличение восстановительного потенциала клеток, обработанных СФ, может быть обусловлено вкладом Р-окисления жирных кислот. Этот вклад может усиливаться при нарушенной продукции NADH в цикле Кребса, поток метаболитов через который лимитирован при ингибировании ОГДГ СФ [256, 334]. Интересно, что наиболее сильный антипролиферативный эффект в клетках как линии C6, так и MCF-7, наблюдается после инкубации со специфическим ингибитором ОАДК, АФ, в то время как определенные интервалы концентраций СФ (0,02-0,2 мМ в клетках C6 и 0,2-1 мМ в MCF-7) характеризуются повышением восстановительного потенциала (Рис. 17C,D). Такое выраженное снижение NAD(P)H:MTT-редуктазной активности при инкубации клеток с АФ может быть опосредовано нарушениями в метаболизме NAD при ингибировании связанной с ним (см. выше) ОАДГ реакции, более важной для гиперэкспрессирующих DHTKD1 клеток линии MCF-7 (Рис. 14A). Таким образом, имеющиеся данные свидетельствуют об ограничениях, препятствующих компенсации при нарушениях ОАДГ реакции, в отличии от ОГДГ реакции, в клеточных линиях C6 и MCF-7.

4.5.2. Эффекты ингибиторов ПДГКна клеточный метаболизм и жизнеспособность

Для исследования действия ингибиторов ПДГК на метаболизм и жизнеспособность клеток также были выбраны две клеточные линии глиобластомы с разной экспрессией компонентов ПДГК (Рис. 18A,B). В отличие от эмбриональной клеточной линии HEK293, обе глиобластомные клеточные линии, T98G и U87, характеризуются более низкой экспрессией всех каталитических компонентов ПДГК, кодируемых генами PDHA1, PDHA2, PDHB, DLAT, PDHX

и DLD (Рис. 18А), а также киназ ПДГ, кодируемых генами PDK1-3 и фосфатазы PDP2 (Рис. 18B). Однако отношения экспрессии компонента E2p (мРНК гена DLAT) к E1p (суммарная мРНК генов PDHA1, PDHA2 и PDHB) схожи в клеточных линиях HEK293 и T98G (Рис. 18C). В то же время, за счет низкой экспрессии гена DLAT (Рис. 18A) отношение E2p / E1p в линии U87 на порядок ниже, чем в HEK293 и T98G (Рис. 18C). Это свидетельствуя о большей важности ПДГК в линиях T98G и HEK293, по сравнению с U87, в которой нарушается поток метаболитов через ПДГ реакцию. Более высокие соотношения экспрессии E3 / E1p в линии T98G, по сравнению с U87 (Рис. 18C) за счет меньшей экспрессии гена DLD (Рис. 18A), вероятно, свидетельствуют также о значимом использовании компонента E3 в реакциях, катализируемых как ПДГК, так и другими комплексами дегидрогеназ 2-оксокислот. Наконец, экспрессия гена PDHX, кодирующего компонент X ПДГК, также меньше в клетках U87 по сравнению с U87 (Рис. 18A). При этом уровни мРНК генов, кодирующих компонент E1p, схожи для двух глиобластомных линий (Рис. 18A).

Рис. 18. Транскриптомные данные по экспрессии компонентов ПДГК и транспортеров монокарбоксилатов в трех линиях клеток. Уровни экспрессии мРНК аннотированных генов интереса были взяты из базы данных GEO. (А) Экспрессия генов, кодирующих каталитические субъединицы ПДГК. (B) Экспрессия генов, кодирующих регуляторные субъединицы ПДГК. (C) Отношение экспрессии компонентов E2 и E1, а также E3 и E1 ПДГК. (D) Экспрессия генов, кодирующих транспортеры пирувата и/или лактата через цитоплазматическую и внутреннюю митохондриальную мембраны. Экспериментальные данные для каждой клеточной линии были взяты из >7 независимых экспериментов и представлены как среднее ± SEM. Гены, чья разница в экспрессии между линиями T98G и U87 наиболее значима, обведены в прямоугольник.

Оценка изменений клеточного метаболизма при блокировании ПДГ реакции проводилась с самым эффективным ингибитором ПДГК in vitro, АцФН (Рис. 12B). Несмотря на сильный ожидаемый эффект АцФМе2 in vivo, полученные результаты было бы сложнее интерпретировать, ввиду время- и концентрационно-зависимого образования активных АцФ и АцФМе, на порядки менее эффективных по сравнению с АцФН (Рис. 12B). Как видно из Рис. 19A, инкубация глиобластомных линий T98G, U87 и LN405 с 0,5 мМ АцФН в течение 5,5 ч значительно изменяет уровни многих клеточных метаболитов. При этом, в отличие от действия СФ, ГФ и АФ, при инкубации разных клеточных линий с АцФН многие метаболиты изменяются схожим образом, несмотря на разницу в экспрессии компонентов ПДГК. В частности, как и ожидается при ингибировании ПДГК, пируват и аминокислоты, деградирующие через пируват, а именно аланин, глицин, серин и треонин, значительно накапливаются под действием АцФН. В то же время уровень цитрата, для которого продукт ПДГ реакции, ацетил-CoA, является непосредственным предшественником, снижается, как и продукты трансформации цитрата в цикле Кребса - 2-оксоглутарат, фумарат и малат. Сниженные уровни 2-оксоглутарата при действии АцФН также сопряжены с падением уровня глутамата.

-3 0 00 30 s ^ 2

В

Amino acids

-30 00 30

2 8

N m •

s

Organic acids

Sugars

Sugars alcohol

Other g compounds

-c

-t -c

* * * Alanine * * Alanine

* * * Glycine Valine * Glycine Valine

* TEi

★ Isoleucine Isoleucine

* Proline * * Proline

* * * Serine ■i a Serine

* » Threonine * * Threonine

* * 4-hydroxyproline * 4-hydroxyproline Aspartic acid Methionine

* * Aspartic acid Methionine * *

* ПГ

* и пи Glutamic acid * Glutamic acid

Ornithine Ornithine

* Tyrosine i Tyrosine Pyruvic acid Citric acid

* * * Pyruvic acid Citric acid

UEJU 1 * *

□ о 2-oxoglutarate Fumaric acid * 2-oxoglutarate Fumaric acid

* * *

* * * Malic acid *; Malic acid

* * Pantothenic acid * Pantothenic acid

* Phosphoric acid * Phosphoric acid Glucaric acid

* * Glucaric acid *

Xylose Xylose Fructose

* L* Fructose IT

* * Glucose Glucose

* ♦ Isomaltose Isomaltose

jT_ * Mannitol * Mannitol

* Erythritol * Erythritol Glycerol-3-P myo inositol-1-P Cholesterol

* Glycerol-3-P myo inositol-1-P aa

Cholesterol

* * AMP * * AMP

* Nicotinamide * Nicotinamide

Рис. 19. Сравнительные метаболические профили глиобластомных клеточных линий, обработанных АцФН и в контрольных условиях. (А) Метаболические пертурбации в клетках линий T98G, Ш7 и LN405, обработанных 0,5 мМ АцФН в течение 5,5 ч указаны как ^2 от изменений относительно соответствующих необработанных клеток. ф) Метаболические различия между необработанными клеточными линиями указаны как log2 относительно уровней в клетках линии Щ7. * указывают достоверные ф < 0.05) отличия согласно тесту Манна-Уитни.

Разная выраженность описанных эффектов, как и изменения прочих метаболитов, не связанных непосредственно с ПДГ реакцией или циклом Кребса, вероятно определяются разницей в исходном метаболизме клеточных линий. В частности, в клетках линии LN405 обнаруживаются более низкие уровни сахаров (фруктозы, изомальтозы, маннитола, эритритола), по сравнению с T98G и U87 (Рис. 19B). После обработки АцФН, уровни указанных сахаров не меняются в клетках LN405, но падают в T98G и U87 (Рис. 19A). В то же время более высокие уровни глутамата и аспартата в линии LN405 (Рис. 19B), наоборот, сопряжены с более значимыми их изменениями в ответ на инкубацию с АцФН (Рис. 19A). Также в клетках линии T98G заметны более низкие уровни различных аминокислот, относительно других линий (Рис. 19B). Особенно это выражено в случае серина, уровень которого наиболее значимо изменяется от АцФН именно в T98G (Рис. 19A). Таким образом, три исследуемые клеточные линии демонстрируют схожие метаболические ответы при действии АцФН, однако можно наблюдать их разную выраженность и изменения дополнительных метаболитов, таких как сахара, нуклеотиды и отдельные аминокислоты, в зависимости от исходных особенностей их метаболизма.

Несмотря на более выраженные изменения уровней многих клеточных метаболитов (Рис. 19A) по сравнению с СФ, ГФ и АФ (Рис. 15A,B), инкубация клеток в течение 5 ч с 0,5 мМ АцФН в минимальной среде (HBSS с глюкозой) не приводила к увеличению восстановительного потенциала в глиобластомных клеточных линиях (Рис. 20A,B). При этом, в отличие от T98G, где указанные концентрации АцФН не изменяли активность NAD(P)H:резазурин-оксидоредуктазы (Рис. 20A), в клетках U87 инкубация с 0,5 мМ АцФН приводила к падению восстановительного потенциала на 30% (Рис. 20B), хотя метаболические изменения в последней были менее выражены (Рис. 19 A). Действительно, восстановительный потенциал складывается из многочисленных первичных и вторичных метаболических изменений, уже не отражающих изначальных пертурбаций в ответ на ингибирование ПДГК, таких как метаболомный профиль. При увеличении же концентрации АцФН (1-20 мМ) клеточная жизнеспособность все же значительно снижается в клетках T98G (Рис. 20А), однако в случае U87, наоборот, происходит возврат к исходному уровню восстановительного потенциала (Рис. 20B).

При более длительной инкубации клеток линии T98G с АцФН в той же минимальной среде наблюдаются периоды локального увеличения клеточной жизнеспособности (при 0,2-0,5 мМ и 2-5 мМ АцФН) на фоне общего ее снижения до 15% от исходного уровня при 20 мМ АцФН (Рис. 20C). В клетках линии U87 наблюдается только падение восстановительного потенциала при больших концентрациях АцФН (Рис. 20D), однако оно выражено слабее (до 70% от исходного уровня при 20 мМ АцФН), по сравнению с T98G. Интересно также, что в обоих клеточных линиях действие АцФН и более слабого ингибитора ПДГК in vitro, АцФМе, после 5 ч

инкубации схожи (Рис. 20A,B). При более длительной инкубации (24 ч) с большими концентрациями ингибиторов ПДГК эффект снижения восстановительного потенциала оказывается значительно выше в случае АцФН (Рис. 20C,D). При этом, в клетках обеих линий АцФМе оказывает некоторое увеличение восстановительного потенциала, хотя и в разных областях концентраций.

Рис. 20. Влияние АцФН (АсРН) и АцФМе (АсРМе) на уровни клеточной жизнеспособности.

Зависимости NAD(P)H:резазурин-оксидоредуктазной активности клеточных линий T98G (А, О) и и87 (Б, Б) после 5 ч (А, Б) или 24 ч (С, D) инкубации в минимальной среде. Данные представлены как среднее ± 8БМ.

Таким образом, клеточная специфичность чувствительности их метаболизма и восстановительного потенциала к действию фосфиновых и фосфоновых аналогов пирувата отражает специфичность последствий ингибирования ПДГК в зависимости от исходной экспрессии его компонентов, ингибирующей способности аналога in vitro и длительности ингибирования.

Поскольку АцФН и АцФМе являются структурными аналогами пирувата, обладающими тем же зарядом при физиологических значениях рН (-1), предположительно, они могут проникать в клетку используя те же переносчики, что и пируват. К тому же, на устойчивость клеточных линий в ответ на ингибирование ПДГК может влиять способность избавляться от накапливающегося вследствие лактатдегидрогеназной реакции лактата. Транскриптомные данные (Рис. 18Б) демонстрируют, что часть генов, кодирующих транспортеры пирувата и лактата, в том числе компоненты митохондриального переносчика пирувата (МРС1 и МРС2), а также клеточные транспортеры преимущественно лактата относительно пирувата (8ЬС16Л3 и 8ЬС16Л8) экспрессируются на схожем уровне в клетках линий T98G и И87. В то же время гены, кодирующие транспортеры преимущественно пирувата относительно лактата (8ЬС16Л1 и 8ЬС16Л7) в клетках И87 экспрессируются в 3 раза ($>ЬС16ЛГ) или в 5 раз (8ЬС16Л7) меньшем уровне, чем в клетках T98G. Поскольку клетки линии И87 менее чувствительны к действию ингибиторов ПДГК на уровне изменений метаболома и восстановительного потенциала (Рис. 19, 20С,Б), сниженный транспорт заряженных синтетических аналогов пирувата также может способствовать резистентности клеток к фармакологическому ингибированию ПДГК.

4.6. Биохимические последствия регуляции дегидрогеназ 2-оксокислот в мозге животных10

4.6.1. Эффекты ингибиторов ОГДК

Действие фосфоновых аналогов 2-оксокислот в качестве ингибиторов дегидрогеназ 2-оксокислот на уровне тканей животных исследовалось в модели краткосрочных эффектов, спустя 24 часа после их интраназального введения. В качестве ингибиторов ОГДК использовали СФ и его полностью этерифицированное производное (ТЭСФ), лучше проникающее внутрь клеток.

Ранее показанные сильные эффекты ингибирования ОГДК на физиологию [16, 18], могут определяться центральной метаболической ролью ОГДГ, чья инактивация может приводить к перестройкам различных метаболических путей, в первую очередь в головном мозге. Для исследования этих путей были измерены активности ферментов центрального метаболизма -

10 При подготовке данного раздела диссертации использованы следующие публикации, выполненные автором лично или в соавторстве, в которых, согласно Положению о присуждении ученых степеней в МГУ, отражены основные результаты, положения и выводы исследования: Artiukhov AV, Graf AV, Kazantsev AV, Boyko AI, Aleshin VA, Ksenofontov AL & Bunik VI (2022) Increasing inhibition of the rat brain 2-oxoglutarate dehydrogenase decreases glutathione redox state, elevating anxiety and perturbing stress adaptation. Pharmaceuticals, 15(2): 182 (вклад 0,55 / 1,06 УПЛ). Aleshin VA, Artiukhov AV, Kaehne T, Graf AV & Bunik VI (2021) Daytime dependence of the activity of the rat brain pyruvate dehydrogenase corresponds to the mitochondrial sirtuin 3 level and acetylation of brain proteins, all regulated by thiamine administration decreasing phosphorylation of PDHA Ser293. International Journal of Molecular Sciences, 22(15):8006 (вклад 0,15 / 1,12 УПЛ). Boyko A, Tsepkova P, Aleshin V, Artiukhov A, Mkrtchyan G, Ksenofontov A, Baratova L, Ryabov S, Graf A & Bunik V (2021) Severe spinal cord injury in rats induces chronic changes in the spinal cord and cerebral cortex metabolism, adjusted by thiamine that improves locomotor performance. Frontiers in Molecular Neuroscience, 14:620593 (вклад 0,2 / 1,38 УПЛ).

метаболических партнеров дегидрогеназ 2-оксокислот - а также уровни аминокислот и их производных в экстрактах коры больших полушарий мозга. В дозе 0,02 ммоль/кг СФ и ТЭСФ оказывали схожие эффекты на метаболизм головного мозга крыс, которые пропадали при увеличении дозы ТЭСФ до 0,1 ммоль/кг (Рис. 21 А). Так, введение обеих форм ингибитора значимо увеличивало активность ОГДК в коре больших полушарий (Рис. 21 Б). Связанные с компенсаторным усилением функции ОГДК биохимические изменения также включали снижение активностей ПДГК (Рис. 21С) и ГС (Рис. 21Б) и увеличение активностей МДГ (Рис. 21Е) и МФ (Рис. 21Б). Увеличение же дозы ТЭСФ вызывает возврат активностей большинства из указанных ферментов к контрольным значениям, за исключением активности ОГДК, которая оказывается выше контрольных значений (Рис. 21 Б).

Наблюдаемые бифазные эффекты ингибирования ОГДК на ферментативные активности также отражаются и на уровне метаболитов, в первую очередь, NAD+ (Рис. 21 G) и глутамата (Рис. 21Н), а также редокс-активных соединений: компонентов редокс-буфера глутатиона (Рис. 211-Ь) и маркера продукции ^N0, цитруллина (Рис. 21М). В частности, изменения уровня окисленного глутатиона противоположны изменениям активности ОГДК: при введении 0,1 ммоль/кг ТЭСФ, снижающей активность ОГДК, наблюдается увеличение уровня окисленного глутатиона. Поскольку, уровни восстановленного и общего глутатиона значимо не меняются (Рис. 211,1), это вызывает снижение редокс-потенциала глутатиона (Рис. 21Ь). В то же время, сниженный уровень цитруллина при введении низких доз СФ/ТЭСФ (Рис. 21 М), при отсутствии изменений в уровнях аргинина и орнитина (Рис. 21А), свидетельствует о падении продукции ^N0 [335, 336].

Таким образом, наблюдается концентрационная зависимость ингибирования ОГДГ на биохимические параметры мозга крыс. Как и в случае с ранее показанными эффектами СФ на различные физиологические и биохимические параметры животных, в том числе компенсаторную активацию ОГДК [16, 18], определенные эффекты ТЭСФ на метаболизм более выражены при низких дозировках ингибитора, так как способствуют компенсации сниженной активности ОГДК. Более высокие дозировки ингибиторов вызывают уже другие эффекты, вызванные невозможностью скомпенсировать инактивацию ОГДК: увеличение уровней различных аминокислот и снижение редокс-потенциала глутатиона.

SP 0.02 mmol/kg (n=12)-TESP 0.02 mmol/kg (n=13)-TESP 0.1 mmol/kg (ri=14)-

* i 4 4 4 4 4 4 ■ПВ * 4 4 Е5Я G

4 ± 4

* * * * * шиш * 4 *

1.0 0.5 0

-0.5 -1.0

В

Э 15-, u.

Ol

Ф Q.

с 1.0 E "5 E

=ä. 0.5 о

< 0.0

kOOOI P<0-001 э=(ГЗз7 P_f0_001

i*. Z--

«

Factor: p < 0.001

H Glu

Ц-IJ.L'U I P"'J LlJ-

■11; 10-

* Î ** Ч--1

H-1-1-1-

Factor: p = 0.002

ч?4v <s о v

О*

С

5 0.8-, и.

О)

3.0.6e E

E

u

< 0.0-

PDHC

p = 0 032 p=0.013

Factor: p = 0.005

S

;

■i „ *

*ip ■ *

Factor: p = 0.200

D

5 150-

Li.

u>

5

Q.

с 100-

I

о £

=L 50£

p-0.029 p<Q.ooi p=0.011 pcO.001

* i

—I—I—I—

////

Factor: p < 0.001

г

p=0.013

>=0.015 p«-0.001

p<0QP1

/Ä/ Factor: p < 0.001

g 500-

L.

I 450-

с

Ё

= 4oo^ E

J.

¿150-

MDH

p-D ,013

p=0.025

i ■ : 1

Ï — и

t

A? „^

Factor: p = 0.003

К

3

GSH+2*GSSG «

ME

p-Q-001 P<0-°01

F

5 1-2-j p=0 046 p<0.001

= 0.6E

a.

¿.0.6>

и

« 0.4

У- *

T-1-1-1-

Factor: p 0.001

GSH/GSSG р^о.отг

! 15"

j

: 10-

I

• '> ¿S * j ; f

^ i,

Factor: p = 0.183

^ ^ чС- ^

Factor: p = 0.022

0.10-1

0.08

J 0.06 a

Ö 0.04E

1 0.Ö2-0.00

-p=0.007

ï—ï-1—ï—

Factor: p = 0.006

M Cit

0.08

3=0.011 p<0-001

5 0.06- J-0.002

f-J

# mS ^

T f «

-1—

Factor: p < 0.001

Рис. 21. Концентрационная зависимость эффектов ингибирования ОГДГ на биохимические индикаторы в коре головного мозга крыс. (A) Уровни аминокислот и ассоциированных соединений, а также активности ОГДК, ПДГК и связанных ферментов указаны как log2 от изменений относительно среднего значения в необработанных ингибиторами ОГДГ животных. (B-F) Активности ОГДК (OGDHC, B), ПДГК (PDHC, C), глутаминсинтазы (GS, D), малатдегидрогеназы (MDH, E) и NADP+-зависимого малик-фермента (ME, F) представлены в виде мкмоль/мин на г ткани. (G-M) Уровни глутамата (G), NAD+ (H), восстановленного глутатиона (GSH, I), окисленного глутатиона (GSSG, J), общего глутатиона (K), соотношение между уровнями восстановленной и окисленной форм глутатиона (L) и уровень цитруллина (Cit, M). Содержания всех метаболитов (G-K, M) представлены в виде мкмоль на г ткани. Достоверные (p < 0,05) отличия между экспериментальными группами согласно дисперсионному анализу с post hoc тестом Тьюки указаны в виде * (А, показывают только отличия от контрольной группы) или значений p-value post-hoc теста на графиках (B-M); значения p-value для значимости факторов указаны под графиками. Полые точки соответствуют выбросам, исключенным из анализа с помощью итеративного теста Граббса. n показывает число животных в экспериментальной группе с учетом выбросов. Протеогенные аминокислоты указаны в соответствии со стандартным 3-буквенным кодом. Оставшиеся сокращения: bAiBA — p-аминоизобутират, pAla - Р-аланин, Car - карнозин, CysSSCys - цистин, CysThi - цистатионин, EA - этаноламин, gABA - у-аминобутират, Orn - орнитин, GDH - глутаматдегидрогеназа.

4.6.2. Эффекты ингибиторов ОАДГ

В отличие от ингибирования ОГДГ его специфическими ингибиторами, СФ и ТЭСФ, ингибиторы ОАДГ, этерифицированные производные ГФ (триэтиловый эфир глутарилфосфоната, ТЭГФ) и АФ (триэтиловый и триметиловый эфиры адипоилфосфоната, ТЭАФ и ТМАФ, соответственно) в меньшей степени оказывают влияние как на активности ферментов, так и на уровни метаболитов (Рис. S3А, 22А). Так, в результате интраназального введения низкой дозы (0,02 ммоль/кг) ТЭГФ, деэтерифицированная форма которого (ГФ) ингибирует и ОГДК, и ОАДК in vitro (см. п.п. 4.3.2-4.3.3), но оказывает те же эффекты, что и специфический ингибитор ОАДК (АФ), на метаболом клеточных линий (Рис. 15, 16), активность ОГДК в коре больших полушарий не меняется (Рис. S3B). Теме не менее, ТЭГФ вызывает компенсаторный рост активности ОАДК (Рис. S3B), аналогично действию той же дозы ТЭСФ на активность ОГДК (Рис. 21B). В отличие от ТЭСФ, введение ТЭГФ не вызывает значительных изменений редокс-метаболизма, что видно по редокс-потенциалу глутатиона (Рис. S3C), но приводит к росту уровня валина (Рис. S3D).

Как и в случае клеточных линий (Рис. 15), действие АФ и ТЭАФ на биохимические параметры в мозге животных значительно отличается от СФ и ТЭСФ. Несмотря на отсутствие эффектов на активности ОГДК и ОАДК (Рис. 22B), специфическими индикаторами действия АФ и ТЭАФ являются повышение уровня Р-аминоизобутирата и снижение уровней ансерина и триптофана (Рис. 22С). При этом, деградация последнего происходит с участием ОАДГ, что согласуется с его незначительным падением при ингибировании ОАДГ в клетках линии MCF-7 (Рис. 15B).

В случае другого производного АФ, ТМАФ, наблюдаемые эффекты ингибирования ОАДГ в головном мозге крыс отличались от таковых для АФ и ТЭАФ, что демонстрируется кластеризацией изменений (Рис. 22A). Так, при одинаковой дозе (0,02 ммоль/кг) ТМАФ вызывал увеличение активностей ОГДК, МДГ, МФ и ГС (Рис. 22B), а также падение уровней Р-аминоизобутирата, Р-аланина, и рост уровня триптофана, противоположный падению при введении АФ и ТЭАФ (Рис. 22C). При этом, аналогично бифазным эффектам ТЭСФ (Рис. 21), наблюдали концентрационную зависимость эффектов ТМАФ на биохимические параметры головного мозга, поскольку увеличение дозы последнего до 0,1 ммоль/кг способствовало большей схожести изменений, вызванных введением ТМАФ, с вызванными введением АФ и ТЭАФ (Рис. 22). Так, пропадали компенсаторные увеличения активностей ферментов (Рис. 22B) и наблюдаемые изменения уровней метаболитов, включая триптофан, что аналогично действию разных доз ТЭСФ на активности ОГДК и ассоциированных ферментов и уровни ассоциированных с ОГДК метаболитов, включая глутамат (Рис. 21 H). Однако, в отличие от АФ и ТЭАФ, введение высокой дозы ТМАФ приводило к увеличению уровней различных

аминокислот. Наконец, при введении низкой дозы ТМАФ наблюдался значимый рост восстановительного потенциала глутатиона (Рис. 22А,С). Данный эффект не наблюдался ни при увеличении дозы ТМАФ, ни при введении других ингибиторов ОАДГ (Рис. 22АС, Б3А,С).

Г

** *** **

* * * ■

* *

ш

Гг

**

до^-а з >-< И(лт>ю 0>Ф о ®

*

* ****

гт ***

Ох о

В OADHC

а>

0.5-

8.

I 0.0-

о

Е -0.5-з.

ё .1.0-1 >

1-1.5

ih

<D (в Ш >

U) О

о

X

о

ОQ1 2.5-^2 й >c-g

ТМАР 0 02 (п=12) ■ ! АР 0 02 (п=8) ТЕАР 0.02 (п=8) ТМАР 0 1 (п=14)

р=0.027 *

S 2-0-1

О)

¡[ 1.5-с

I ? 10

Е Э.

» 0.5-

—I-1-1-1-Г-

&

J» Z1 i4 .(Г Factor: р=0.023

< 0.0

OGDHC

р<0.001

U

п

5 700-1

с 5002

Г ЯГ V

MDH

ps0.020 р=0.038 р<0.001

р=6 604

р>0.014