Механизм интернализации апоптотической протеазы растений тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.08, кандидат наук Трусова Светлана Владимировна

• Трусова Светлана Владимировна
• кандидат наук
• 2019

Оглавление диссертации кандидат наук Трусова Светлана Владимировна

Список сокращений и условных обозначений

Введение

1. Субтилазы растений, их участие в стрессах и ПКС (обзор литературы)

1.1. Общая характеристика субтилизин-подобных протеаз

1.2. Особенности строения растительных субтилаз

1.2.1. Продомен

1.2.2. РА домен и в-шпилька каталитического домена

1.2.3. Фибронектин Ш-подобный домен

1.3. Субтилазы и стрессы у растений

1.3.1. Солевой стресс и субтилазы

1.3.2. Участие субтилаз в ответе на заражение патогенами

1.4. Программированная клеточная смерть у растений

1.4.1. Отсутствие апоптоза у растений

1.4.2. Вакуолярная клеточная смерть

1.4.3. Некротическая клеточная смерть у растений

1.4.4. Смешанные формы программированной клеточной смерти у растений

1.5. Субтилазы в программированной клеточной смерти: фитаспазы

1.5.1. Структура фитаспазы

1.5.2. Участие фитаспаз в развитии ПКС

1.5.3. Динамическая локализация фитаспазы в растении

2. Материалы и методы

2.1. Используемые штаммы бактерий и линии растений

2.2. Реактивы

2.3. Буферы и растворы

2.4. Векторы и плазмиды

2.4.1. Готовые векторы и плазмиды

2.4.2. pLEX7000/A tPhyt-mRFP

2.4.3. pLEX7000/mRFP

2.4.4. pCambia/EGFP-Hub1

2.4.5. pCambia/EGFP-Hub2

2.5. Получение компетентных клеток E. coli

2.6. Трансформация клеток E. coli

2.7. Трансформация агробактерий

2.8. Выращивание растений

2.9. Транзиентная продукция белков в листьях растений

2.10. Транзиентная продукция белков в проростках

2.11. Обработка антимицином А

2.12. Обработка метилвиологеном и хлоридом натрия

2.13. Окрашивание реагентом Evans Blue

2.14. Флуоресцентная микроскопия

2.15. Фракционирование листовой массы

2.16. ПААГ и вестерн-блот

2.17. Флуориметрический анализ активности фитаспаз

3. Перемещение фитаспазы из апопласта во внутриклеточное пространство осуществляется по клатрин-зависимому пути (результаты и их обсуждение)

3.1. Фитаспаза табака в нормальных условиях экспортируется во внеклеточное пространство

3.2. При стрессе фитаспаза табака меняет свою локализацию на внутриклеточную

3.3. Обработка антимицином А вызывает признаки клеточной смерти

3.4. Повышение активности фитаспазы вызывает признаки нарушения проницаемости клеточной мембраны

3.5. После изменения локализации фитаспаза сохраняет целостность и функциональную активность

3.6. Фитаспаза арабидопсиса ведет себя аналогично в проростках арабидопсиса

3.7. Фитаспаза арабидопсиса в гетерологичной системе (в листьях бентамианы) спонтанно перемещается в клетку

3.8. Фитаспаза арабидопсиса в бентамиане входит в клетку без индукции клеточной смерти

3.9. Фитаспаза входит в клетку специфично

3.10. Фитаспаза входит в клетку в составе мембранных везикул

3.11. Ингибитор клатрин-зависимого эндоцитоза Hub препятствует интернализации фитаспазы

3.12. Ингибитор клатрин-зависимого эндоцитоза препятствует интернализации активности фитаспазы

3.13. Ингибитор клатрин-зависимого эндоцитоза препятствует развитию признаков клеточной смерти

4. Заключение

5. Выводы

6. Список литературы

Список сокращений и условных обозначений

Для аминокислот и их производных использовались однобуквенные и трехбуквенные обозначения, рекомендуемые комиссией по номенклатуре Международного союза чистой и прикладной химии (IUPAC) и Международного союза биохимиков (IUP) [1]. Для нуклеиновых кислот использовались обозначения, рекомендуемые IUPAC и IUP [2].

В работе использовались также следующие сокращения и обозначения: АФК - активные формы кислорода БСА - бычий сывороточный альбумин ВТМ - вирус табачной мозаики ГО - гиперчувствительный ответ ДМСО - диметилсульфоксид ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота ДСН - додецилсульфат натрия ДТТ - дитиотреитол кДа - килодальтон ПААГ - полиакриламидный гель ПКС - программированная клеточная смерть ПСА - персульфат аммония ПЦР - полимеразная цепная реакция ПЭГ - полиэтиленгликоль РНК - рибонуклеиновая кислота

Т-ДНК - ДНК, переносимая агробактериями в клетку растения (транспортируемая ДНК, transferred DNA)

Трис - трис (гидроксиметил) аминометана

ЭДТА - этилен диамин тетраацетат ЭПР - эндоплазматический ретикулум Ac - ацетил

AEBSF - 4-(2-аминоэтил) бензолсульфонил фторид гидрохлорид

AFC - 7-амино-4-(трифторметил) кумарин

Amp - ампициллин

APX - аскорбат пероксидаза

At - Arabidopsis thaliana: арабидопсис, арабидопсисный BPB - бром-феноловый синий Carb - карбенициллин CAT - каталаза

CHX - циклогексимид (cycloheximide)

CMK - хлорметилкетон (chloromethyl ketone)

Col-0 - экотип арабидопсиса Arabidopsis thaliana Columbia-0

DAPI - 4',6'-диамидино-2-фенилиндол дигидрохлорид

ECD - внеклеточный домен (extracellular domain)

EGFP - улучшенный зеленый флуоресцентный белок (enhanced green fluorescent protein) ETI - иммунитет, связанный с распознаванием эффекторов (effector-triggered immunity Fn III - фибронектин III

FT - флуоресцентный таймер (fluorescent timer) Gent - гентамицин

GFP - зеленый флуоресцентный белок (green fluorescent protein) IAP - белок-ингибитор апоптоза (inhibitor of apoptosis) Kan - канамицин

LRR - домен, содержащий лейциновые повторы (богатый остатками лейцина, leucine-rich repeat)

MAMP - молекулярный паттерн, характерный для микроба (microbial-associated molecular pattern)

MAP киназа - митоген-активируемая протеинкиназа (mitogen-activated protein kinase) MES - 2-(№морфолино) этансульфоновая кислота

mRFP - мономерный красный флуоресцентный белок (monomelic red fluorescent protein) Nb - Nicotiana benthamiana: бентамиана, относящийся к бентамиане NB - нуклеотид-связывающий домен (nucleotide binding)

NCCD - Комитет по номенклатуре клеточной смерти (Nomenclature Committee on Cell Death)

NLS - сигнал ядерной локализации (nuclear localization signal)

Nt - Nicotiana tabacum: табак, табачный

PA - ассоциированный с протеазами (protease-associated)

PAMP - молекулярный паттерн, характерный для патогена (pathogen-associated molecular pattern)

PME - пектинметилэстераза

PR - связанный с патогененезом (pathogenesis related)

PRR - рецептор, распознающий паттерн (pattern-recognition receptor)

PTI - иммунитет, связанный с распознаванием паттернов (pattern-triggered immunity)

Rubisco - рибулозо-1,5-бисфосфат карбоксилаза/оксигеназа

PVDF - поливинилиденфторид

Rif - рифампицин

SBT - субтилаза

Sl - Solanum lycopersicum: томат, томатный

St - Solanum tuberosum: картофель, картофельный

Spec - спектиномицин Strep - стрептомицин

TEMED - ^^№,№-тетраметилэтилендиамин

VPE - вакуолярный процессирующий фермент (vacuolar processing enzyme) Р-мэ - Р-меркаптоэтанол

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Механизм интернализации апоптотической протеазы растений»

Введение

У растений, как и у других многоклеточных организмов, существует механизм программированной клеточной смерти (ПКС), который позволяет им избавляться от отдельных клеток как при нормальном развитии определенных органов и тканей, так и в ситуациях стресса, например, при вирусном заражении. Как и у животных, у растений ПКС осуществляется с участием протеолитических ферментов, обладающих редко встречающейся аспартатной субстратной специфичностью. У растений такие ферменты были открыты в 2004 году и позже получили название «фитаспазы», то есть «растительные аспартат-специфичные протеазы» [3]. Фитаспазы оказались структурно не похожи на каспазы животных и относятся к классу серин-зависимых субтилизин-подобных протеаз (субтилаз). При изучении фитаспазы табака было выявлено необычное поведение этого фермента. Экспортируясь, как и большинство субтилаз, во внеклеточное пространство (апопласт) сразу после синтеза, фитаспаза затем в условиях ПКС возвращается в клетку [4]. Ни для одной другой субтилазы не описано подобное возвращение. Это совершенно новое явление, поэтому изучение механизма интернализации фитаспазы является актуальной задачей.

Впервые фитаспаза была охарактеризована для табака МсоЫапа tabacum. Была показана вовлеченность фитаспазы в развитие стресс-индуцированной ПКС и ее строгая субстратная специфичность: фитаспаза гидролизует белки-субстраты исключительно после остатка аспарагиновой кислоты, находящегося в определенном контексте. Такая субстратная специфичность нехарактерна для большинства субтилизин-подобных протеаз. Было установлено, что интернализация изначально экспортированной в апопласт фитаспазы происходит как под воздействием биотических факторов (гиперчувствительный ответ), так и абиотических воздействий (осмотический стресс, окислительный стресс). В дальнейшем фитаспазы были обнаружены у многих растений: у риса, томата, перца, сельдерея и других. Также было обнаружено, что у одного растения может быть несколько фитаспаз с различающимися предпочтительными сайтами гидролиза (при этом требование к наличию остатка аспарагиновой кислоты в позиции Р1 субстрата остается неизменным).

На примере фитаспазы табака было показано, что обнаруживаемый при стрессе во внутреннем пространстве клетки фермент является не вновь синтезированным, а именно возвратившимся из апопласта. Была предложена схема функционирования фитаспазы: на первом этапе происходит синтез белка в виде препрофермента, который автокаталитически

и конститутивно процессируется и в виде активного фермента экспортируется из клетки, что характерно для большинства субтилаз. Второй этап жизненного цикла фитаспазы необычен и включает ее обратный (ретроградный) транспорт в клетку при индукции ПКС. Механизм, по которому происходит этот обратный транспорт, до настоящего момента не был известен.

Целью данной работы являлось выяснение механизма интернализации фитаспазы. В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи:

1. Установить, является ли интернализация фитаспазы специфичным процессом.

2. Выяснить, сохраняет ли фитаспаза после вхождения в клетку протеолитическую активность, или же это путь ее деградации.

3. Исследовать возможные механизмы интернализации фитаспазы.

4. Исследовать наличие корреляции между транспортом фитаспазы в клетку и развитием признаков клеточной смерти.

Объектом исследования выступали фитаспазы табака, бентамианы и арабидопсиса, а предметом исследования - их динамическая локализация в условиях развития ПКС в растениях.

Научная новизна работы: впервые показано, что интернализация фитаспазы происходит с помощью клатрин-зависимого эндоцитоза. Обнаружено, что ингибитор клатрин-зависимого эндоцитоза, белок Hub, препятствует вхождению фитаспазы внутрь растительной клетки при индукции окислительного стресса в листьях бентамианы Nicotiana benthamiana и в проростках арабидопсиса Arabidopsis thaliana. Показана специфичность интернализации фитаспазы табака (NtPhyt) с помощью специально сконструированного маркера апопласта, белка SP-mRFP. Показано, что при индукции ПКС суммарная активность фитаспазы сохраняется приблизительно на постоянном уровне, но при этом происходит ее перемещение из апопласта во внутриклеточную фракцию; присутствие в системе белка Hub препятствует этому. Аналогичное динамическое поведение выявлено и для фитаспазы арабидопсиса (AtPhyt) в проростках арабидопсиса: ее интернализация также происходит стресс-зависимо и клатрин-опосредовано. В то же время, при транзиентной продукции в листьях бентамианы фитаспазы арабидопсиса AtPhyt-EGFP обнаруживается спонтанное перемещение белка AtPhyt-EGFP во внутриклеточное пространство. Показана корреляция между транспортом фитаспазы NtPhyt в клетку и развитием признаков

клеточной смерти, таких как нарушение целостности клеточной мембраны. Уточнена модель функционирования фитаспазы, согласно которой фитаспаза при индукции ПКС возвращается в растительную клетку по пути клатрин-зависимого эндоцитоза в составе мембранных везикул.

Теоретическая и практическая значимость работы. В работе впервые показано, что механизмом, с помощью которого осуществляется интернализация фитаспазы, является клатрин-зависимый эндоцитоз. Ранее клатрин-зависимая интернализация не была известна для субтилаз. Выявлено, что клатрин-зависимый эндоцитоз играет важную роль в осуществлении ПКС растительных клеток. Результаты работы представляют существенный научный интерес и способствуют пониманию процессов, вызванных реакцией растения на стресс-индуцирующие воздействия.

Поскольку ПКС и ее регуляция важны как для нормального развития растений, так и для их взаимодействия с окружающей средой, включая защиту от патогенов, то полученные результаты имеют не только фундаментальное, но и практическое значение.

Методология диссертационного исследования. Изучение интернализации фитаспазы осуществляли непосредственно в растениях, применяя подходы биоинженерии живых систем. Для получения генно-инженерных конструкций, транзиентной продукции белков в растениях, изучения их взаимного расположения, фракционирования и анализа полученных фракций использованы современные методы молекулярной биологии, биохимии и флуоресцентной микроскопии. Клонирования осуществляли с помощью клеток Escherichia coli. Транзиентную продукцию белков осуществляли в листьях 5-недельных растений N. benthamiana, в семядольных листьях 7-дневных проростков N. benthamiana либо 5-дневных проростков A. thaliana методом агробактериальной инфильтрации с использованием штаммов Agrobacterium tumefaciens GV3101 и C58C1. В случае взрослых растений инфильтрацию листьев проводили с помощью шприца, а при работе с проростками - в вакуум-эксикаторе. За локализацией белков в живом препарате листа растения следили методами конфокальной флуоресцентной микроскопии. Отделение апопластной фракции осуществляли, центрифугируя образец на низкой скорости по известной методике. Качество целевых белков в полученных фракциях оценивали методом вестерн-блот анализа, а ферментативную активность фитаспаз - с помощью гидролиза специфичных синтетических флуорогенных субстратов фитаспаз, измеряя относительную интенсивность флуоресценции в реакционной смеси в течение нескольких часов. Обработку результатов измерений выполняли с помощью программного обеспечения

Microsoft Excel. Данные по активности фитаспазы представлены в виде среднее ± стандартное отклонение для не менее, чем трех образцов. Для статистического анализа использовали t-критерий.

Положения, выносимые на защиту:

1. Фитаспазы табака (NtPhyt) и бентамианы (NbPhyt) в листьях бентамианы, а также фитаспаза арабидопсиса (AtPhyt) в проростках арабидопсиса перемещаются из апопласта внутрь клеток под воздействием индуктора окислительного стресса антимицина А.

2. Интернализация фитаспаз происходит специфично.

3. Фитаспаза попадает в клетку в составе мембранных везикул.

4. Ингибитор клатрин-зависимого эндоцитоза белок Hub препятствует интернализации фитаспазы табака и арабидопсиса.

5. Интернализованная фитаспаза сохраняет гидролитическую активность.

6. Активная фитаспаза способствует, а ингибитор клатрин-зависимого эндоцитоза препятствует проявлению признаков клеточной смерти.

Личный вклад соискателя заключается в анализе данных литературы, планировании экспериментов, их постановке, обработке полученных экспериментальных данных, интерпретации результатов, подготовке публикаций. Основные результаты получены непосредственно автором.

Степень достоверности. Все данные получены неоднократно. Достоверность подтверждается регулярной воспроизводимостью результатов, а также статистической обработкой данных.

Апробация результатов. Результаты работы были представлены на конференциях: 4th International Symposium on Plant Signaling and Behavior, Санкт-Петербург, Россия, 2016; Международной научной конференции по биоорганической химии «XII чтения памяти академика Ю. А. Овчинникова» - VIII Российском симпозиуме «Белки и пептиды», Москва, Россия, 2017; 42nd FEBS Congress, Иерусалим, Израиль, 2017; 43rd FEBS Congress, Прага, Чехия, 2018; 4th Plant Protease and PCD Symposium, Гент, Бельгия, 2018.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ (4 статьи в рецензируемых научных журналах, индексируемых Scopus и Web of Science, и 5 тезисов докладов).

1. Субтилазы растений, их участие в стрессах и ПКС (обзор литературы)

Высшие растения в подавляющем большинстве являются малоподвижными формами жизни и по этой причине не способны оградить себя от неблагоприятных условий окружающей среды, к которым относятся изменения в освещенности, температуре, степени засоленности и обводненности почвы; конкуренция с другими растениями; нападения насекомых, травоядных млекопитающих; заражение вирусами, бактериями-некротрофами и так далее. Растения не могут убежать, поменять условия существования. Однако для противодействия неблагоприятным факторам у растений имеется широкий спектр форм пассивной защиты: шипы, жгучие волоски, прочные суберинизированные и лигнифицированные оболочки (суберин - это основной компонент древесной коры, а лигнин - проводящей системы, древесины). Отложения лигнина и суберина придают растению прочность и служат достаточной защитой от мелких насекомых и других животных. Структурные защитные элементы растений разнообразны; к ним относятся и клеточная стенка - физическое препятствие для микроорганизмов и грибов; и кутикула -гидрофобный слой, который формируется снаружи от листьев растений и предотвращает излишнюю потерю влаги, а также затрудняет патогенным организмам доступ к живым клеткам. Защитной функцией обладают и трихомы - волоски на поверхности листьев и стеблей растений. Например, трихомы на листьях соевых бобов Glycine max затрудняют насекомым доступ к эпидермису для откладывания яиц, а трихомы картофеля и томата выделяют масла, отталкивающие вредителя растений - тлю [5]. Помимо морфологического уровня защиты, у растений имеются и механизмы врожденного иммунитета. Выделяют два уровня активной иммунной защиты растений, которые связаны с распознаванием присутствия патогена либо во внеклеточном пространстве в тканях растения, либо внутри клетки. Один из видов такого иммунитета растений получил название «pattern-triggered immunity», PTI - иммунитет, связанный с распознаванием определенных эволюционно консервативных молекулярных паттернов патогенов (паттерны PAMP или MAMP, pathogen or microbial-associated molecular patterns). Примерами PAMP являются фрагменты бактериальных флагеллинов, липопротеинов, липополисахаридов или хитины грибов [6, 7]. В плазматической мембране растений располагаются рецепторы PRR, распознающие эти паттерны (pattern-recognition receptors) благодаря наличию внеклеточного домена ECD (extracellular domain). Среди PRR выделяют рецептор-

подобные киназы, которые помимо трансмембранного и внеклеточного домена содержат также цитоплазматический киназный домен. Рецептор-подобные киназы могут быть лишены домена ECD, а также существуют PRR, которые не обладают киназным доменом -в этом случае их называют рецептор-подобными белками. Распознавание сигнальных мотивов с помощью домена ECD приводит к гомо- или гетероолигомеризации рецепторов PRR и запуску внутриклеточных иммунных ответов [8]. В ходе коэволюции патогены, в свою очередь, разработали механизмы, позволяющие им избегать распознавания рецепторами PRR или подавлять PTI. Со своей стороны, растения развили второй уровень защиты - иммунитет, активируемый эффектором (effector-triggered immunity, ETI). Этот уровень иммунной защиты активируется при распознавании белков-эффекторов патогенов в цитоплазме и реализуется через взаимодействие эффекторов с белками NB-LRR, которые кодируются генами устойчивости к патогенам (R-генами). Будучи активированным, ETI вызывает синтез сигнальных молекул, которые могут транспортироваться в соседние с зараженными клетки. Передача сигнала осуществляется активацией MAP киназного каскада, что, в свою очередь, приводит к накоплению салициловой кислоты и продукции ряда белков, ассоциированных с патогенезом (их называют PR-белками, pathogenesis-related). PR-белки обычно не являются специфичными к конкретному патогену и могут обладать противомикробной, противогрибковой или противовирусной активностью [9]. Таким образом, активация ETI повышает общую устойчивость растения к инфекциям. Непосредственно в пораженных патогеном клетках ETI может приводить к гиперчувствительному ответу и ПКС [10].

На молекулярном уровне одним из способов ответа на внешнее воздействие является расщепление белков, то есть протеолиз - быстрое и необратимое изменение статуса определенных белков, например, транскрипционных факторов [11]. Протеолиз может быть как точечным (процессирующим), так и неизбирательным (деградирующим), но в любом случае происходит изменение функционального статуса целевой молекулы. Благодаря выборочному гидролизу белков можно контролировать различные аспекты роста, развития и ответа растений на внешние стимулы и повреждения [12]. Ферменты, осуществляющие протеолиз - протеазы - могут осуществлять как деградацию белков, так и быть вовлеченными и в более тонкие процессы, внося в молекулы белков-субстратов посттрансляционные модификации путем их гидролиза по строго определенным сайтам. Ограниченный протеолиз может требоваться для сборки белков и белковых комплексов, для внутриклеточной адресной доставки белков; при помощи специфичного гидролиза

белков-предшественников осуществляется контроль их ферментативной активности, регуляторных или сигнальных функций [13, 14]. Участвующие в регуляторных процессах протеазы, конечно, должны обладать более строгими субстратными предпочтениями, а их активность - точно регулироваться, как во времени, так и в пространстве; с помощью протеаз растение может осуществлять регуляцию и контролировать ответ на различные стимулы [15].

Огромное число протеаз растений относится к группе сериновых протеаз. Среди сериновых протеаз растений широко представлено семейство субтилизин-подобных протеаз (субтилаз), гомологичных бактериальному белку субтилизину. Среди субтилаз встречаются как ферменты без особых субстратных предпочтений, обеспечивающие деградацию белков, так и протеазы с высокой субстратной специфичностью, осуществляющие процессинг определенных субстратов. Такие субтилазы участвуют, например, в процессах регуляции роста и развития [16].

1.1. Общая характеристика субтилизин-подобных протеаз

Согласно базе данных MEROPS, субтилазы относятся к семейству сериновых протеаз S8, куда входят субтилизин грамположительной бактерии Bacillus subtilis (сенной палочки) и его гомологи, которые были найдены у всех представителей живого мира: бактерий, архей, эукариот. В семействе выделяют два подсемейства: субтилизин-подобные протеазы входят в подсемейство S8A, а кексин и кексин-подобные протеазы составляют подсемейство S8B [17]. Кексин-подобные протеазы обладают более строгими субстратными предпочтениями, но у растений не были обнаружены, тогда как протеазы подсемейства S8A у растений представлены очень широко. В каталитическом центре субтилаз помимо серина, определяющего название группы сериновых протеаз, выделяют также аспартат и гистидин. Эта каталитическая триада свойственна не только семейству S8, но в случае субтилизин-подобных протеаз располагается в полипептидной цепи в характерном порядке: Asp, His, Ser, - отличном от такового в других семействах сериновых протеаз, таких как S1, S9 и S10, имеющих те же аминокислотные остатки в активном центре.

В подсемействе S8A аминокислотные остатки активного центра часто располагаются в мотивах Asp-Thr/Ser-Gly, His-Gly-Thr-His и Gly-Thr-Ser-Met-Ala-Xaa-Pro,

что отличает их от подсемейства S8B, где каталитическая триада находится в ином окружении, а именно Asp-Asp-Gly, His-Gly-Thr-Arg и Gly-Thr-Ser-Ala/Val-Ala/Ser-Pro.

Большинство членов семейства S8 - эндопротеазы, хотя, например, белок трипептидил пептидаза TPP-II (или AtSBT6.2 в случае арабидопсиса, S08.A56 по классификации MEROPS) является экзопептидазой, отщепляющей трипептиды с N-конца белков. Большая часть представителей семейства активна при нейтральном или слабощелочном pH. Многие протеазы семейства довольно термостабильны и являются Са2+-зависимыми. Большая часть представителей семейства являются неспецифичными протеолитическими ферментами с предпочтительным гидролизом по гидрофобным остаткам [17].

Субтилизин B. subtilis синтезируется в виде препрофермента, на N-конце которого расположен сигнальный пептид, обеспечивающий секрецию белка за пределы клетки. Следом идет продомен, который автокаталитически отщепляется в процессе созревания фермента, а за ним - каталитический субтилизиновый домен. Эти особенности характерны как для бактериальных субтилизинов, так и для большинства субтилизин-подобных протеаз растений и других эукариот [16]. Третичная структура зрелого субтилизина представлена обширным сильно скрученным ß-листом, состоящим из семи параллельных и антипараллельных ß-тяжей. Этот ß-лист окружает две центральные a-спирали и, в свою очередь, с боков окружен несколькими периферийными a-спиралями. Активный центр субтилизина экспонирован на поверхности молекулы в виде довольно широкого и открытого канала, что позволяет войти в него совершенно разным фрагментам полипептидной цепи белка-субстрата и определяет его низкую субстратную избирательность (Рисунок 1) [18].

1.2. Особенности строения растительных субтилаз

Субтилазы растений обладают рядом особенностей, которые отличают их от субтилаз других организмов. Прежде всего можно заметить, что количество субтилаз у высших растений довольно велико: 56 у арабидопсиса Arabidopsis thaliana [19, 20], 63 у риса Oriza sativa [21], 82 у томата Solanum lycopersicum [22], 80 у винограда Vitis vinifera [23], в то время как у человека их всего лишь девять. Количество генов субтилаз у каждого растения, проанализированного к настоящему моменту, выше, чем таковое у человека, что

Рисунок 1. Структура субтилизина Карсберг в комплексе с ингибитором эглином С. Семь аминокислотных остатков эглина С (Р5 - Р2'), связанные с активным центром субтилизина, показаны в виде палочковой модели. Каталитическая триада субтилизина показана светло-зеленым.

позволяет предположить важную роль субтилаз в биологии растений. Увеличение числа субтилаз у растений по сравнению с другими организмами сопровождается их более узкой специализацией и приобретением функций, специфичных для растений. Показано, что субтилазы растений участвуют в развитии устьиц, семян, фруктов, апикальной меристемы стебля и клеточной стенки, в процессинге белковых факторов роста, а также в ответах на биотические и абиотические стресс-индуцирующие воздействия и в реализации программированной клеточной смерти [16, 24]. Роль многих других субтилаз, однако, все еще остается невыясненной. У одного из рекордсменов по числу субтилизин-подобных протеаз - винограда - для двух членов семейства субтилаз была предсказана хлоропластная локализация (ЬОС100250428 и LOC100265894) и еще для одного - митохондриальная (ЬОС100255614), что позволяет предположить их вероятную роль в функционировании хлоропластов и митохондрий, соответственно [23].

Для субтилаз растений, как и для других субтилаз, характерна достаточно высокая термостабильность. Однако по крайней мере для некоторых из них показано отсутствие зависимости от ионов Са2+ [25], а также более низкое оптимальное значение рН [4, 26], что может быть связано с кислотностью апопласта (рН около 5,5), в котором локализовано большинство субтилаз растений.

Как и бактериальные субтилизины, субтилизин-подобные протеазы растений синтезируются в виде препрофермента, на N-конце которого располагается сигнальный пептид. Это короткая аминокислотная последовательность, благодаря наличию которой белок направляется в просвет эндоплазматического ретикулума (ЭПР) и далее на экспорт из клетки, если у молекулы белка отсутствуют дополнительные адресные сигналы. Огромное количество субтилаз растений попадают таким образом во внеклеточное пространство, апопласт. В состав препрофермента также входят продомен и каталитический домен. У подавляющего большинства субтилаз растений зачастую выделяют два дополнительных домена: домен, ассоциированный с протеазами (protease-associated, PA), который в первичной структуре полипептида располагается внутри субтилазного домена между остатками гистидина и серина каталитической триады, и С-концевой фибронектин Ш-подобный домен (Fn III-like domain). Схематическое изображение пространственной структуры и первичной полипептидной цепи типичных представителей семейства растительных субтилаз: кукумизина из плодов дыни [27] и белка томата S1SBT3 [28], - представлены на Рисунке 2.

1.2.1. Продомен

Продомен субтилаз выполняет несколько важных функций. Прежде всего, это внутримолекулярный шаперон, который обеспечивает правильную пространственную организацию каталитического домена [29-31]. В отсутствие продомена денатурированные молекулы субтилазы томата SBT3 не способны вновь принять правильную, нативную конформацию in vitro. В то же время, если в растворе присутствуют молекулы продомена, даже не связанные пептидной связью с субтилазным доменом, происходит правильное сворачивание активных молекул фермента, которое, однако, идет в 1000 раз медленнее в случае, если продомен действует in trans (добавлен отдельно, не в составе пробелка), по сравнению с его внутримолекулярным присутствием [32]. Ситуация оказалась еще более наглядной при продукции белков in vivo: если белок SBT3 дикого типа, как и ожидалось, экспортировался из клетки, то лишенный продомена белок SBT3APP детектировали только внутри клетки, причем уровень продукции был снижен, что говорит о том, что белок не

1 23 111 331 465 634 731 1 23 113 343 473 655 761

D140 Н204 N307 S525 D144 Н215 N317 S538

Щ Signal [] Prodomain Щ Subtilase □ РА Щ Fnlll-like peptide domain domain domain

Рисунок 2. Структуры субтилаз кукумизина (код в банке данных белков Protein Data Bank (PDB) 3VTA) и S1SBT3 (PDB код 3I74). Ковалентно связанный ингибитор показан зеленым. Боковые радикалы аминокислотных остатков активного центра Asp, His и Ser показаны светло-голубым. Домен PA показан оранжевым цветом. C-концевой Fn Ш-подобный домен показан темно-синим. Ингибирующая Р-шпилька белка S1SBT3 показана розовым, а a-спирали, взаимодействующие с продоменом, показаны голубым в структуре кукумизина. Схематичное изображение первичной структуры белков представлено под трехмерными моделями.

проходит «контроль качества» в ЭПР и направляется на деградацию [33, 34]. Когда же в одних и тех же клетках продуцировали одновременно две разных полипептидных цепи, одна из которых соответствовала субтилазе, лишенной продомена, SBT3ДPP, а другая -продомену SBT3PP этой же субтилазы, то видели накопление субтилазы SBT3ДPP в апопласте. Таким образом, продомен выступает как молекулярный шаперон, даже будучи продуцированным отдельно от субтилазного домена. При этом взаимодействие между продоменом и субтилазным доменом крайне специфично: использование продомена субтилазы томата SBT1.4PP, имеющего 90% идентичности по аминокислотной последовательности с SBT3PP, приводит к крайне слабому экспорту субтилазы SBT3ДPP в апопласт, а использование менее похожих продоменов и вовсе не дает детектируемого количества субтилазы SBT3ДPP в апопласте [32].

При правильном сворачивании профермента С-конец продомена, соединенный с ^концом каталитического субтилазного домена пептидной связью, оказывается протянут через карман активного центра (Рисунок 3). Продомен связан с каталитическим доменом не

Рисунок 3. Структура комплекса субтилизина с продоменом. Субтилазный домен показан темно-желтым, а продомен розовым. Каталические остатки активного центра субтилизина Asp32, His64 и Cys221, а также остаток Туг77 на С-конце продомена показаны детально. Изображение создано с использованием программного обеспечения MOLSCRIPT.

только через полипептидную цепь, но и взаимодействует с ним своей поверхностью, формируя водородные связи. Поэтому даже после автокаталитического гидролиза продомен остается связан с субтилазным доменом и продолжает выполнять другую свою функцию - ингибиторную [35, 36]. После отщепления продомена неструктурированный вконец протеазного домена принимает конформацию а-спирали и отдаляется от продомена и каталитического кармана, тогда как С-конец продомена продолжает занимать активный центр субтилазного домена. Такое ингибирование предотвращает проявление активности фермента в условиях, когда она не нужна. Окончательное отсоединение продомена происходит рН-зависимо при выходе ферментов из ЭПР в аппарат Гольджи или сеть транс-Гольджи [32].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Трусова Светлана Владимировна, 2019 год

6. Список литературы

1. Nomenclature and symbolism for amino acids and peptides, Pure Appl. Chem., 1984, 106, 3-17.

2. Secrist J. A. Nucleoside and nucleotide nomenclature, Curr. Protoc. Nucleic Acid Chem., 2000, 00(1), A.1D.1-A.1D.3.

3. Chichkova N. V., Kim S. H., Titova E. S., Kalkum M., Morozov V. S., Rubtsov Y. P., Kalinina N. O., Taliansky M. E., Vartapetian A. B. A plant caspase-like protease activated during the hypersensitive response, Plant Cell, 2004, 16(1), 157-171.

4. Chichkova N. V., Shaw J., Galiullina R. A., Drury G. E., Tuzhikov A. I., Kim S. H., Kalkum M., Hong T. B., Gorshkova E. N., Torrance L., Vartapetian A. B., Taliansky M. Phytaspase, a relocalisable cell death promoting plant protease with caspase specificity, EMBO Journal, 2010, 29(6), 1149-1161.

5. Freeman B. C., Beattie G. A. An overview of plant defenses against pathogens and herbivores, Plant Health Instr., 2008, DOI: 10.1094/phi-i-2008-0226-01

6. Bigeard J., Colcombet J., Hirt H. Signaling mechanisms in pattern-triggered immunity (PTI), Molecular Plant, 2015, 8(4), 521-539.

7. Monaghan J, Zipfel C. Plant pattern recognition receptor complexes at the plasma membrane, Current Opinion in Plant Biology, 2012, 15(4), 349-357.

8. He K., Wu Y. Receptor-like kinases and regulation of plant innate immunity, Enzymes, 2016, 40, 105-142.

9. Goyal R. K., Mattoo A. K. Plant antimicrobial peptides in Host defense peptides and their potential as therapeutic agents, Acs Chem Biol, 2016, 5, 111-136.

10. Lyapina I., Filippova A., Fesenko I. The role of peptide signals hidden in the structure of functional proteins in plant immune responses, Int. J. Mol. Sci., 2019, 20(18), 4343.

11. Liu J. X., Srivastava R., Che P., Howell S. H. Salt stress responses in Arabidopsis utilize a signal transduction pathway related to endoplasmic reticulum stress signaling, Plant J., 2007, 51(5), 897-909.

12. Vierstra R. D. Proteolysis in plants: mechanisms and functions, Plant Mol. Biol., 1996, 32(1-2), 275-302.

13. Schaller A. A cut above the rest: the regulatory function of plant proteases, Planta, 2004, 220(2), 183-197.

14. Vierstra R. D. The ubiquitin-26S proteasome system at the nexus of plant biology, Nature Reviews Molecular Cell Biology, 2009, 10(6), 385-397.

15. van der Hoorn, R. A. L. Plant proteases: from phenotypes to molecular mechanisms, Annu. Rev. Plant Biol., 2008, 59, 191-223.

16. Schaller, A., Stintzi, A., Graff, L. Subtilases - versatile tools for protein turnover, plant development, and interactions with the environment, Physiologia Plantarum, 2012, 145(1), 52-66.

17. Rawlings N. D., Barrett A. J., Thomas P. D., Huang X., Bateman A., Finn R. D. The MEROPS database of proteolytic enzymes, their substrates and inhibitors in 2017 and a comparison with peptidases in the PANTHER database, Nucleic Acids Res., 2018, 46(D1), D624-D632.

18. Kagawa T. F., O'Connell M. R., Mouat P., Paoli M., O'Toole P. W., Cooney J. C. Model for substrate interactions in C5a peptidase from Streptococcus pyogenes: A 1.9 A crystal structure of the active form of ScpA, J. Mol. Biol., 2009, 386(3), 754-72.

19. Beers E. P., Jones A. M., Dickerman A. W. The S8 serine, C1A cysteine and A1 aspartic protease families in Arabidopsis, Phytochemistry, 2004, 65(1), 43-58.

20. Rautengarten C., Steinhauser D., Bussis D., Stintzi A., Schaller A., Kopka J., Altmann T. Inferring hypotheses on functional relationships of genes: Analysis of the Arabidopsis thaliana subtilase gene family, PLoS Comput. Biol., 2005, 1(4), e40.

21. Tripathi, L. P., Sowdhamini, R. Cross genome comparisons of serine proteases in Arabidopsis and rice, BMC Genomics, 2006, 7, 200.

22. Reichardt S., Repper D., Tuzhikov A. I., Galiullina R. A., Planas-Marques M., Chichkova N. V., Vartapetian A. B., Stintzi A., Schaller A. The tomato subtilase family includes several cell death-related proteinases with caspase specificity, Sci. Rep., 2018, 8, 1-14.

23. Cao J., Han X., Zhang T., Yang Y., Huang J., Hu X. Genome-wide and molecular evolution analysis of the subtilase gene family in Vitis vinifera, BMC Genomics, 2014, 15, 1116.

24. Rose R., Schaller A., Ottmann C. Structural features of plant subtilases, Plant Signal. Behav., 2010, 5(2), 180-183.

25. Ottmann C., Rose R., Huttenlocher F., Cedzich A., Hauske P., Kaiser M., Huber R., Schaller A. Structural basis for Ca2+-independence and activation by homodimerization of tomato subtilase 3, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2009, 106(40), 17223-17228.

26. Chichkova N. V. , Galiullina R. A., Mochalova L. V. , Trusova S. V. , Sobri Z. M., Gallois P., Vartapetian A. B. Arabidopsis thaliana phytaspase: identification and peculiar properties, Functional Plant Biology, 2018, 45(1-2), 171-179.

27. Murayama K., Kato-Murayama M., Hosaka T., Sotokawauchi A., Yokoyama S., Arima K., Shirouzu M. Crystal structure of cucumisin, a subtilisin-like endoprotease from cucumis melo L., J. Mol. Biol., 2012, 423(3), 386-396.

28. Cedzich A., Huttenlocher F., Kuhn B. M., Pfannstiel J., Gabler L., Stintzi A., Schaller A. The protease-associated domain and C-terminal extension are required for zymogen processing, sorting within the secretory pathway, and activity of tomato subtilase 3 (SlSBT3), J. Biol. Chem., 2009, 284(21), 14068-14078.

29. Subbian E., Williamson D. M., Shinde U. Protein folding mediated by an intramolecular chaperone: energy landscape for unimolecular pro-subtilisin E maturation, Adv. Biosci. Biotechnol., 2015, 06(02), 73-88.

30. Takagi H., Koga M., Katsurada S., Yabuta Y., Shinde U., Inouye M., Nakamori S. Functional analysis of the propeptides of subtilisin E and aqualysin I as intramolecular chaperones, FEBSLett., 2001, 508(2), 210-214.

31. Jia Y., Liu H., Bao W., Weng M., Chen W., Cai Y., Zheng Z., Zou G. Functional analysis of propeptide as an intramolecular chaperone for in vivo folding of subtilisin nattokinase, FEBS Lett., 2010, 584(23), 4789-4796.

32. Meyer M., Leptihn S., Welz M., Schaller A. Functional characterization of propeptides in plant subtilases as intramolecular chaperones and inhibitors of the mature protease, J. Biol. Chem., 2016, 291(37), 19449-19461.

33. Liu Y., Li J. Endoplasmic reticulum-mediated protein quality control in Arabidopsis, Frontiers in Plant Science, 2014, 5, 162.

34. Brodsky J. L., Skach W. R. Protein folding and quality control in the endoplasmic reticulum: Recent lessons from yeast and mammalian cell systems, Current Opinion in Cell Biology, 2011, 23(4), 464-475.

35. Jain S. C., Shinde U., Li Y., Inouye M., Berman H. M. The crystal structure of an autoprocessed Ser221 Cys-subtilisin E-propeptide complex at 2.0 A resolution, J. Mol. Biol., 1998, 284(1), 137-144.

36. Nakagawa M., Ueyama M., Tsuruta H., Uno T., Kanamaru K., Mikami B., Yamagata H. Functional analysis of the cucumisin propeptide as a potent inhibitor of its mature enzyme, J. Biol. Chem., 2010, 285(39), 29797-29807 .

37. Janzik I., Macheroux P., Amrhein N., Schaller A. LeSBT1, a subtilase from tomato plants. Overexpression in insect cells, purification, and characterization, J. Biol. Chem., 2000, 275(7), 5193-5199.

38. Yamagata H., Masuzawa T., Nagaoka Y., Ohnishi T., Iwasaki T. Cucumisin, a serine protease from melon fruits, shares structural homology with subtilisin and is generated from a large precursor, J. Biol. Chem., 1994, 269(52), 32725-32731.

39. Tornero P., Conejero V., Vera P., Identification of a new pathogen-induced member of the subtilisin-like processing protease family from plants, J. Biol. Chem., 1997, 272(22), 14412-14419.

40. Luo X., Hofmann K. The protease-associated domain: a homology domain associated with multiple classes of proteases, Trends in Biochemical Sciences, 2001, 26(3), 147-148.

41. Gaspar T., Franck T., Bisbis B., Kevers C., Jouve L., Hausman J.F., Dommes J. Concepts in plant stress physiology. Application to plant tissue cultures, Plant Growth Regul., 2002, 37(3), 263-285.

42. Mosa K. A., Ismail A., Helmy M. Introduction to plant stresses, Plant Stress Tolerance, 2017. D0I:10.1007/978-3-319-59379-1_1

43. Lee J., Giordano S., Zhang J. Autophagy, mitochondria and oxidative stress: cross-talk and redox signalling, Biochem. J., 2012, 441(2), 523-540.

44. Song Y., Zhang C., Ge W., Zhang Y., Burlingame A. L., Guo Y. Identification of NaCl stress-responsive apoplastic proteins in rice shoot stems by 2D-DIGE, J. Proteomics, 2011, 74(7), 1045-1067.

45. Alonso J. M., Stepanova A. N., Leisse T. J., Kim C. J., Chen H., Shinn P., Stevenson D. K., Zimmerman J., Barajas P., Cheuk R., Gadrinab C., Heller C., Jeske A., Koesema E., Meyers C. C., Parker H., Prednis L., Ansari Y., Choy N., Deen H., Geralt M., Hazari N., Hom E., Karnes M., Mulholland C., Ndubaku R., Schmidt I., Guzman P., Aguilar-Henonin L., Schmid M., Weigel D., Carter D. E., Marchand T., Risseeuw E., Brogden D., Zeko A., Crosby W. L., Berry C. C., Ecker J. R. Genome-wide insertional mutagenesis of Arabidopsis thaliana, Science., 2003, 301(5633), 653-657.

46. Wolf S., Rausch T., Greiner S. The N-terminal pro region mediates retention of unprocessed type-I PME in the Golgi apparatus, Plant J., 2009, 58(3), 361-375.

47. Xiao Y., Stegmann M., Han Z., DeFalco T. A., Parys K., Xu L., Belkhadir Y., Zipfel C., Chai J. Mechanisms of RALF peptide perception by a heterotypic receptor complex, Nature, 2019, 572(7768), 270-274.

48. Stegmann M., Monaghan J., Smakowska-Luzan E., Rovenich H., Lehner A., Holton N., Belkhadir Y., Zipfel C. The receptor kinase FER is a RALF-regulated scaffold controlling plant immune signaling, Science, 2017, 355(6322), 287-289.

49. Srivastava R., Liu J. X., Guo H., Yin Y., Howell S. H. Regulation and processing of a plant peptide hormone, AtRALF23, in Arabidopsis, Plant J., 2009, 59(6), 930-339.

50. Vera P., Conejero V. Pathogenesis-related proteins of tomato: p-69 as an alkaline endoproteinase, Plant Physiol., 1988, 87(1), 58-63.

51. Tornero P., Conejero V., Vera P. Primary structure and expression of a pathogen-induced protease (PR-P69) in tomato plants: Similarity of functional domains to subtilisin-like endoproteases, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 1996, 93(13), 6332-6337.

52. Jorda L., Coego A., Conejero V., Vera P. A genomic cluster containing four differentially regulated subtilisin- like processing protease genes is in tomato plants, J. Biol. Chem., 1999, 274(4), 2360-2365.

53. Jorda L., Conejero V., Vera P. Characterization of P69E and P69F, two differentially regulated genes encoding new members of the subtilisin-like proteinase family from tomato plants, Plant Physiol., 2000, 122(1), 67-74.

54. Jorda L., Vera P. Local and systemic induction of two defense-related subtilisin-like protease promoters in transgenic Arabidopsis plants. Luciferin induction of PR gene expression, Plant Physiol., 2000, 124(3), 1049-1057.

55. Vidhyasekaran P. Salicylic acid signaling in plant innate immunity. Plant hormone signaling systems in plant innate immunity, Signaling and Communication in Plants, 2015, 2, 27-122.

56. Ramírez V., López A., Mauch-Mani B., Gil M. J., Vera P. An extracellular subtilase switch for immune priming in Arabidopsis, PLoSPathog., 2013, 9(6), e1003445.

57. Kroemer G., Galluzzi L., Vandenabeele P., Abrams J., Alnemri E. S., Baehrecke E. H., Blagosklonny M. V., El-Deiry W. S., Golstein P., Green D. R., Hengartner M., Knight R. A., Kumar S., Lipton S. A., Malorni W., Nuñez G., Peter M. E., Tschopp J., Yuan J., Piacentini M., Zhivotovsky B., Melino G. Classification of cell death: recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2009, Cell Death and Differentiation, 2009, 16(1), 3-11.

58. van Doorn W. G., Beers E. P., Dangl J. L., Franklin-Tong V. E., Gallois P., Hara-Nishimura I., Jones A. M., Kawai-Yamada M., Lam E., Mundy J., Mur L. A., Petersen M., Smertenko A., Taliansky M., van Breusegem F., Wolpert T., Woltering E., Zhivotovsky B., Bozhkov P. V. Morphological classification of plant cell deaths, Cell Death and Differentiation, 2011, 18(8), 1241-1246.

59. Fink S. L., Cookson B. T. Apoptosis, pyroptosis, and necrosis: mechanistic description of dead and dying eukaryotic cells, Infection and Immunity, 2005, 73(4), 1907-1916.

60. Hatsugai N., Kuroyanagi M., Yamada K., Meshi T., Tsuda S., Kondo M., Nishimura M., Hara-Nishimura I. A plant vacuolar protease, VPE, mediates, virus-induced hypersensitive cell death, Science, 2004, 305(5685), 855-858.

61. Müntz K. Protein dynamics and proteolysis in plant vacuoles, Journal of Experimental Botany, 2007, 58(10), 2391-2407.

62. Drew M. C., He C. J., Morgan P. W. Programmed cell death and aerenchyma formation in roots, Trends in Plant Science, 2000, 5(3), 123-127.

63. Gunawardena A. H. L. A. N. Programmed cell death and tissue remodelling in plants, Journal of Experimental Botany, 2008, 59(3), 445-451.

64. Bollhöner B., Prestele J., Tuominen H. Xylem cell death: emerging understanding of regulation and function, Journal of Experimental Botany, 2012, 63(3), 1081-1094.

65. van Durme M., Nowack M. K. Mechanisms of developmentally controlled cell death in plants, Current Opinion in Plant Biology, 2016, 29, 29-37.

66. Galluzzi L., Vitale I., Aaronson S. A., Abrams J. M., Adam D., Agostinis P., Alnemri E. S., Altucci L., Amelio I., Andrews D. W., Annicchiarico-Petruzzelli M., Antonov A. V., Arama E., Baehrecke E. H., Barlev N. A., Bazan N. G., Bernassola F., Bertrand M. J. M., Bianchi K., Blagosklonny M. V., Blomgren K., Borner C., Boya P., Brenner C., Campanella M., Candi E., Carmona-Gutierrez D., Cecconi F., Chan F. K., Chandel N. S., Cheng E. H., Chipuk J. E., Cidlowski J. A., Ciechanover A., Cohen G.M., Conrad M., Cubillos-Ruiz J. R., Czabotar P. E., D'Angiolella V., Dawson T. M., Dawson V. L., De Laurenzi V., De Maria R., Debatin K. M., DeBerardinis R. J., Deshmukh M., Di Daniele N., Di Virgilio F., Dixit V. M., Dixon S. J., Duckett C. S., Dynlacht B. D., El-Deiry W. S., Elrod J. W., Fimia G. M., Fulda S., Garcia-Saez A. J., Garg A. D., Garrido C., Gavathiotis E., Golstein P., Gottlieb E., Green D. R., Greene L. A., Gronemeyer H., Gross A., Hajnoczky G., Hardwick J. M., Harris I. S., Hengartner M. O., Hetz C., Ichijo H., Jäättelä M., Joseph B., Jost P. J., Juin P. P., Kaiser W. J., Karin M., Kaufmann T., Kepp O., Kimchi A., Kitsis R. N., Klionsky D. J. Knight R. A., Kumar S., Lee S. W., Lemasters J. J., Levine B., Linkermann A., Lipton S. A., Lockshin R. A., Lopez-Otin C., Lowe S. W., Luedde T., Lugli E., MacFarlane M., Madeo F., Malewicz M., Malorni W., Manic G., Marine J. C., Martin S. J., Martinou J. C., Medema J. P., Mehlen P., Meier P., Melino S., Miao E. A., Molkentin J. D., Moll U. M., Munoz-Pinedo C., Nagata S., Nunez G., Oberst A., Oren M., Overholtzer M., Pagano M., Panaretakis T., Pasparakis M., Penninger J. M., Pereira D. M., Pervaiz S., Peter M. E., Piacentini M., Pinton P., Prehn J. H. M., Puthalakath H., Rabinovich G. A., Rehm M., Rizzuto R., Rodrigues C. M. P., Rubinsztein D. C., Rudel T., Ryan K. M., Sayan E., Scorrano L., Shao F., Shi Y., Silke J., Simon H. U., Sistigu A., Stockwell B. R., Strasser A., Szabadkai G., Tait S. W. G., Tang D., Tavernarakis N., Thorburn A., Tsujimoto Y., Turk B., Vanden Berghe T., Vandenabeele P.,

Vander Heiden M. G., Villunger A., Virgin H. W., Vousden K. H., Vucic D., Wagner E. F., Walczak H., Wallach D., Wang Y., Wells J. A., Wood W., Yuan J., Zakeri Z., Zhivotovsky B., Zitvogel L., Melino G., Kroemer G., Molecular mechanisms of cell death: recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2018, Cell Death and Differentiation, 2018, B(3), 486-541.

67. van Aken O., van Breusegem F. Licensed to kill: mitochondria, chloroplasts, and cell death, Trends in Plant Science, 2015, 20(11), 754-766.

68. Bashir Z., Ahmad A., Shafique S., Anjum T., Shafique S., Akram W. Hypersensitive response — a biophysical phenomenon of producers, Eur. J. Microbiol. Immunol., 2013, 3(2), 105-110.

69. Heath M. C. Hypersensitive response-related death, Plant Mol. Biol., 2000, 44(3), 321-334.

70. Liu Y., Ren D., Pike S., Pallardy S., Gassmann W., Zhang S. Chloroplast-generated reactive oxygen species are involved in hypersensitive response-like cell death mediated by a mitogen-activated protein kinase cascade, Plant J., 2007, 51(6), 941-9954.

71. Dinesh-Kumar S. P., Tham W. H., Baker B. J. Structure-function analysis of the tobacco mosaic virus resistance gene N, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2000, 97(26), 14789-14794.

72. Wolpert T. J., Dunkle L. D., Ciuffetti L. M. Host-selective toxins and avirulence determinants: what's in a name?, Annu. Rev. Phytopathol., 2002, 40, 251-285.

73. Curtis M. J., Wolpert T. J. The victorin-induced mitochondrial permeability transition precedes cell shrinkage and biochemical markers of cell death, and shrinkage occurs without loss of membrane integrity, Plant J., 2004, 38(2), 244-259.

74. McIlwain D. R., Berger T., Mak T. W. Caspase functions in cell death and disease, Cold Spring Harb. Perspect. Biol., 2013, 5(4), a008656.

75. Shalini S., Dorstyn L., Dawar S., Kumar S. Old, new and emerging functions of caspases, Cell Death and Differentiation, 2015, 22(4), 526-539.

76. Fuchs Y., Steller H. Programmed cell death in animal development and disease, Cell, 2011, 147(4), 742-758.

77. Bonneau L., Ge Y., Drury G. E., Gallois P. What happened to plant caspases?, Journal of Experimental Botany, 2008, 59(3), 491-499.

78. Kabbage M., Kessens R., Bartholomay L. C., Williams B. The life and death of a plant cell, Annu. Rev. Plant Biol., 2017, 68, 375-404.

79. Ge Y., Cai Y. M., Bonneau L., Rotari V., Danon A., McKenzie E. A., McLellan H., Mach L., Gallois P. Inhibition of cathepsin B by caspase-3 inhibitors blocks programmed cell death in Arabidopsis, Cell Death Differ., 2016, 23(9), 1493-1501.

80. del Pozo O., Lam E. Caspases and programmed cell death in the hypersensitive response of plants to pathogens, Curr. Biol., 1998, 8(20), 1129-1132 .

81. Navarre D. A., Wolpert T. J. Victorin induction of an apoptotic/senescence-like response in oats, Plant Cell, 1999, 11(2), 237-249.

82. Coffeen W. C., Wolpert T. J. Purification and characterization of serine proteases that exhibit caspase-like activity and are associated with programmed cell death in Avena sativa, Plant Cell, 2004, 16(4), 857-873.

83. Hatsugai N., Yamada K., Goto-Yamada S., Hara-Nishimura I. Vacuolar processing enzyme in plant programmed cell death, Front. Plant Sci., 2015, 6, 234.

84. Yamada K., Shimada T., Nishimura M., Hara-Nishimura I. A VPE family supporting various vacuolar functions in plants, PhysiologiaPlantarum, 2005,123(4), 369-375.

85. Bosch M., Poulter N. S., Perry R. M., Wilkins K. A., Franklin-Tong V. E. Characterization of a legumain/vacuolar processing enzyme and YVADase activity in Papaver pollen, Plant Mol. Biol., 2010, 74(4-5), 381-393.

86. Hatsugai N., Hara-Nishimura I. Measurement of the caspase-1-like activity of vacuolar processing enzyme in plants, Methods in Molecular Biology, 2018, 1743, 163-171.

87. Lopez-Fernandez M. P., Maldonado S. Programmed cell death in seeds of angiosperms, J. Integr. Plant Biol., 2015, 57(12), 996-1002.

88. Nakaune S., Yamada K., Kondo M., Kato T., Tabata S., Nishimura M., Hara-Nishimura I., A vacuolar processing enzyme, SVPE, is involved in seed coat formation at the early stage of seed development, Plant Cell, 2005, 17(3), 876-887.

89. Müller G. L., Drincovich M. F., Andreo C. S., Lara M. V. Role of photosynthesis and analysis of key enzymes involved in primary metabolism throughout the lifespan of the tobacco flower, J. Exp. Bot., 2010, 61(13), 3675-3688.

90. Zhang H., Zheng X., Zhang Z. The role of vacuolar processing enzymes in plant immunity, Plant Signaling and Behavior, 2010, 5(12), 1565-1567.

91. Vartapetian A. B., Tuzhikov A. I., Chichkova N. V., Taliansky M., Wolpert T. J. A plant alternative to animal caspases: Subtilisin-like proteases, Cell Death Differ., 2011, 18(8), 1289-1297.

92. Narayanan S., Sanpui P., Sahoo L., Ghosh S. S. Heterologous expression and functional characterization of phytaspase, a caspase-like plant protease, Int. J. Biol. Macromol., 2017, 95, 288-293.

93. Subach F. V., Subach O. M., Gundorov I. S., Morozova K. S., Piatkevich K. D., Cuervo A. M., Verkhusha V. V. Monomeric fluorescent timers that change color from blue to red report on cellular trafficking, Nat. Chem. Biol., 2009, 5(2), 118-126.

94. Тужиков А. И. Структура и свойства фитаспазы Nicotiana tabacum, Кандидатская диссертация по специальности 03.01.03 - Молекулярная биология (хим. науки), 2011.

95. Samuel G. Some experiments on inoculating methods with plant viruses, and on local lesions, Ann. Appl. Biol., 1931, 18(4), 494-507.

96. Kiraly L., Hafez Y. M., Fodor J., Kiraly Z. Suppression of tobacco mosaic virus-induced hypersensitive-type necrotization in tobacco at high temperature is associated with downregulation of NADPH oxidase and superoxide and stimulation of dehydroascorbate reductase, J. Gen. Virol., 2008, 89(Pt 3), 799-808.

97. Mysore K. S., Bassuner B., Deng X. B., Darbinian N. S., Motchoulski A., Ream W., Gelvin S. B. Role of the Agrobacterium tumefaciens VirD2 protein in T-DNA transfer and integration, Mol. Plant-Microbe Interact., 1998, 11(7), 668-683.

98. Howard E. A., Zupan J. R., Citovsky V., Zambryski P. C. The VirD2 protein of A. tumefaciens contains a C-terminal bipartite nuclear localization signal: Implications for nuclear uptake of DNA in plant cells, Cell, 1992, 68(1), 109-118.

99. van Kregten M., Lindhout B. I., Hooykaas P. J. J., van der Zaal B. J. Agrobacterium-mediated T-DNA transfer and integration by minimal vird2 consisting of the relaxase domain and a type IV secretion system translocation signal, Mol. Plant-Microbe Interact., 2009, 22(11), 1356-1365.

100. Reavy B., Bagirova S., Chichkova N. V., Fedoseeva S. V., Kim S. H., Vartapetian A. B., Taliansky M. E. Caspase-resistant VirD2 protein provides enhanced gene delivery and expression in plants, Plant Cell Rep., 2007, 26(8), 1215-1219.

101. Beloshistov R. E., Dreizler K., Galiullina R. A., Tuzhikov A. I., Serebryakova M. V., Reichardt S., Shaw J., Taliansky M. E., Pfannstiel J., Chichkova N. V., Stintzi A., Schaller A., Vartapetian A. B. Phytaspase-mediated precursor processing and maturation of the wound hormone systemin, New Phytol., 2018, 218(3), 1167-1178.

102. Trusova S. V, Volik P. I., Chichkova N. V, Vartapetian A. B. Abscisic acid-induced re-localization of phytaspase, FEBS open bio., 2018, 8, 411-412.

103. Minina E. A., Filonova L. H., Daniel G., Bozhkov P. V. Detection and measurement of necrosis in plants, MethodsMol. Biol., 2013, 1004, 229-248.

104. Abramoff M. D., Magalhaes P. J., Ram S. J. Image processing with imageJ, Biophotonics International, 2004, 11(7), 36-42.

105. Bourne R., Bourne R. ImageJ, Fundamentals of Digital Imaging in Medicine, Springer, 2010, 185-188.

106. Sukhacheva E. A., Evstafieva A. G., Fateeva T. V., Shakulov V. R., Efimova N. A., Karapetian R. N., Rubtsov Y. P., Vartapetian A. B. Sensing prothymosin alpha origin, mutations and conformation with monoclonal antibodies, J. Immunol. Methods, 2002, 266(1-2), 185-96.

107. Trusova S. V., Golyshev S. A., Chichkova N. V., Vartapetian A. B. Sometimes they come back: endocytosis provides localization dynamics of a subtilase in cells committed to cell death, J. Exp. Bot, 2019, 70(7), 2003-2007.

108. Trusova S. V., Teplova A. D., Golyshev S. A., Galiullina R. A., Morozova E. A., Chichkova N. V., Vartapetian A. B. Clathrin-mediated endocytosis delivers proteolytically active phytaspases into plant cells. Frontiers in Plant Sciences, 2019, 10, 873.

109. Morsy M. R., Almutairi A. M., Gibbons J., Yun S. J., de los Reyes B. G. The OsLti6 genes encoding low-molecular-weight membrane proteins are differentially expressed in rice cultivars with contrasting sensitivity to low temperature, Gene, 2005, 344, 171-180.

110. Sweetlove L. J., Heazlewood J. L., Herald V., Holtzapffel R., Day D. A., Leaver C. J., Millar A. H. The impact of oxidative stress on Arabidopsis mitochondria, Plant J., 2002, 32(6), 891-904.

111. Sugimoto K., Okegawa Y., Tohri A., Long T. A., Covert S. F., Hisabori T., Shikanai T. A single amino acid alteration in PGR5 confers resistance to antimycin a in cyclic electron transport around PSI, Plant Cell Physiol., 2013, 54(9), 1525-1534.

112. Nguyen H. M., Sako K., Matsui A., Suzuki Y., Mostofa M. G., Ha C. V., Tanaka M., Tran L. P., Habu Y., Seki M. Ethanol enhances high-salinity stress tolerance by detoxifying reactive oxygen species in Arabidopsis thaliana and Rice, Front. Plant Sci., 2017, 8, 1001.

113. Kato-Noguchi H., Kugimiya T. Effects of ethanol on growth of rice seedlings, Plant Growth Regul, 2001, 35(1), 93-96.

114. Galiullina R., Serebryakova M., Vartapetian A., Chichkova N. Phytaspase activity levels in edible plants: champions and outsiders, FEBS Open Bio., 2018, 8, 159-159.

115. Gilroy E. M., Hein I., van der Hoorn R., Boevink P. C., Venter E., McLellan H., Kaffarnik F., Hrubikova K., Shaw J., Holeva M., López E. C., Borras-Hidalgo O., Pritchard L., Loake G. J., Lacomme C., Birch P. R. Involvement of cathepsin B in the plant disease resistance hypersensitive response, Plant J., 2007, 52(1), 1-13.

116. Jelínková A., Malínská K., Simon S., Kleine-Vehn J., Parezová M., Pejchar P., Kubes M., Martinec J., Friml J., Zazímalová E., Petrásek J. Probing plant membranes with FM dyes: Tracking, dragging or blocking?, Plant J., 2010, 61(5), 883-892.

117. Dhonukshe P., Aniento F., Hwang I., Robinson D. G., Mravec J., Stierhof Y. D., Friml J. Clathrin-mediated constitutive endocytosis of PIN auxin efflux carriers in Arabidopsis, Curr. Biol., 2007, 17(6), 520-527.

118. Sorkin A. Cargo recognition during clathrin-mediated endocytosis: a team effort, Current Opinion in Cell Biology, 2004, 16(4), 392-399.

119. Reynolds G. D., Wang C., Pan J., Bednarek S. Y. Inroads into internalization: five years of endocytic exploration, Plant Physiol., 2018, 176(1), 208-218.

120. Claus L. A. N., Savatin D. V., Russinova E. The crossroads of receptor-mediated signaling and endocytosis in plants, Journal of Integrative Plant Biology, 2018, 60(9), 827-840.

121. Cucu B., Degreif D., Bertl A., Thiel G. Vesicle fusion and fission in plants and yeast, Cell Calcium, 2017, 67, 40-45.

122. Perez-Gomez J., Moore I. Plant endocytosis: it is clathrin after all, Current Biology, 2007, 17(6), R217-219.

123. Reyes F. C., Buono R., Otegui M. S. Plant endosomal trafficking pathways, Current Opinion in Plant Biology, 2011, 14(6), 666-673.