Клонирование и экспрессия в E.coli пенициллинацилаз для получения мутантных форм с улучшенными свойствами тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.23, кандидат химических наук Ясная, Анна Сергеевна

• Ясная, Анна Сергеевна
• кандидат химических наук
• 2009

Оглавление диссертации кандидат химических наук Ясная, Анна Сергеевна

ОГЛАВЛЕНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

2.1. Основные свойства пенициллинацилаз.

2.1.1. Распространенность и физиологическая роль.

2.1.2. Молекулярные свойства.

2.1.3. Структура пенициллинацилазы-G.

2.1.4. Молекулярный механизм (каталитический механизм).

2.1.5. Физико-химические свойства.

2.2. Экспрессия пенициллинацилазы G.

2.2.1. Экспрессия рекомбинантных ПА в E.coli.

2.3. Применение пенициллинацилазы.

2.3.1. Гидролиз пенициллинов для производства 6-АПК.

2.3.2. Синтез (3-лактамных антибиотиков.

2.3.3. Биокаталитическое разделение энаитиомеров аминосоединений.

2.3.4. Пептидный синтез.

2.3.5. Разделение смеси рацематов.

2.4. Белковая инженерия.

2.4.1. Гибридные ферменты.

2.4.2. Ненаправленный мутагенез.

2.4.3. Направленный мутагенез.

2.4.4. Пермутированные ферменты.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.1. Материалы.

3.2. Методы исследования.

3.2.1. Проведение полимеразной цепной реакции.

3.2.2. Очистка ПЦР-продуктов.

3.2.3. Рестрикция фрагментов ДНК.

3.2.4. Рестрикция плазмидной ДНК.

3.2.5. Электрофорез ДНК в агарозном геле.

3.2.6. Выделение рестрикционных фрагментов.

3.2.7. Лигирование фрагментов ДНК.

3.2.8. Трансформация клетокcoli.

3.2.9. Выделение плазмидной ДНК.

3.2.10. Секвенирование ДНК.

3.2.11. Препаративная наработка биомассы.

3.2.12. Выделение пенициллинацилазы G.

3.2.13. Электрофорез в полиакриламидном геле (SDS-электрофорез).

3.2.14. Титрование активных центров фермента.

3.2.15. Измерение активности фермента.

3.2.16. Определение рН растворов.

3.2.17. Изучение рН зависимости активности ферментов.

3.2.18. Изучение термостабильности фермента.

3.2.19. Реакция синтеза ампициллина.

3.2.20. Определение соотношения начальных скоростей синтеза и гидролиза S/H ri параметра относительной специфичности а.

3.2.21. Ферментативное ацилирование рацемата 2-амипобутанола амидами R- и S-миндальной кислоты.

3.2.22. Ферментативный гидролиз рацемата N-фепилацетил-фенилаланинола.

3.2.23. ВЭЖХ анализ.

3.2.24. Компьютерное моделирование.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1. Получение мутантных форм пенициллинацилазы из E.coli и изучение их свойств.

4.1.1. Клонирование гена пенициллинацилазы из E.coli.

4.1.2. Экспрессия рекомбинантного фермента в клетках E.coli TG-1.

4.1.3. Получение мутантных форм ЕсПА из E.coli.

4.1.4. Оптимизация условий экспрессии мутантных ЕсПА.

4.1.5. Изучение свойств мутантных ЕсПА.

4.2. Клонирование ПА из A.faecalis и изучение ее свойств.

4.2.1. Клонирование в E.coli гена пенициллинацилазы из A.faecalis.

4.2.2. Экспрессия гена ПА из A.faecalis в клетках E.coli.

4.2.3. Свойства пенициллинацилазы из A.faecalis.

4.3. Моделирование структуры нативного и пермутированного фермента

ПА из A.faecalis.

4.3.1. Компьютерное моделирование структуры ПА из A.faecalis.

4.3.2. Компьютерное моделирование структуры пермутированного фермента. Дизайн сшивок.

5. ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Клонирование и экспрессия в E.coli пенициллинацилаз для получения мутантных форм с улучшенными свойствами»

Пенициллинацилаза (ПА, КФ 3.5.1.11) была открыта, как катализатор гидролиза амидной связи в антибиотиках пенициллинового ряда. Этот фермент относится к классу гидролаз, подклассу амидогидролаз и является представителем семейства, так называемых N-концевых нуклеофильных гидролаз. ПА была найдена в бактериях, дрожжах и низших грибах. Физиологическая роль фермента до конца не ясна. По-видимому, он служит для утилизации гетероциклических соединений в качестве источника углерода.

ПА изучается уже более 40 лет. По типу гидролизуемого субстрата ПА делят на 3 класса. Ферменты класса I осуществляют предпочтительный гидролиз пенициллина V, а классов II и III - пенициллина G и ампициллина соответственно. Класс II, в свою очередь, делится на два подкласса: Па и 116. Относящиеся к ним ПА гидролизуют ароматические и алифатические амиды, соответственно. Для двух пенициллинацилаз G (класс Па) известны трехмерные структуры, в том числе, для фермента из E.coli (£сПА).

На практике этот фермент нашел широкое применение в производстве 6-аминопенициллановой кислоты - основного сиитона для получения Р-лактамных антибиотиков. Также ПА применяется непосредственно для синтеза различных полусинтетических антибиотиков пенициллинового ряда. Такие свойства этого фермента, как широкая субстратная специфичность, высокие регио-, хемо- и стереоселективность позволяют использовать его для получения оптически-чистых соединений (они все больше используются в фармацевтической промышленности), а также для защиты гидроксильных и аминогрупп в пептидном и тонком органическом синтезе.

Наиболее широко на практике применяется пенициллинацилаза из E.coli. Среди других пенициллинацилаз этот фермент изучен лучше всего, однако эффективность катализируемого ЕсПА ацильного переноса на (3-лактамные ядра не достаточна для того, чтобы полностью вытеснить уже устаревшие методы химического синтеза антибиотиков. Кроме того, сейчас очень остро стоит проблема распространения антибиотико-резистентности у патогенных штаммов, в связи с чем возникает задача получения новых антибиотиков из неприродных субстратов. Поэтому задача получения новых мутантных форм фермента с улучшенными синтетическими характеристиками по отношению к неприродным субстратам имеет большое практическое и фундаментальное значение. Другой, не менее важной и актуальной задачей является повышение стереоселективности ПА в реакциях ацилирования аминоспиртов или гидролиза их N-ацильных производных, так как значение стереоселективности для аминоспиртов на порядок ниже, чем для аминокислот, что недостаточно для практических задач.

Для решения подобных задач могут быть использованы различые подходы, например, изменение свойств ферментов методами неупорядоченного (направленная эволюция, генная мозаика и т.д.) или направленного мутагенеза. В настоящее время все более широко используется последний подход, однако он требует наличия трехмерной структуры фермента, которая может быть получена экспериментально (реитгеноструктурный анализ, ЯМР) или с помщью компьютерного моделирования. Другой подход - это поиск аналогичных ферментов с нужными свойствами. Наилучшие результаты дает комбинация обоих подходов для решения одной и той же задачи.

Целью данной работы было получение мутантных форм пенициллинацилазы из E.coli с улучшенными каталитическими характеристиками в реакциях синтеза антибиотиков и с повышенной стереоселективностью по отношению к аминоспиртам. Наличие трехмерной структуры различных вариантов ЕсПА дикого типа и ее мутантов позволяет использовать для этой цели метод «рационального дизайна», основанный на введении в структуру фермента направленных аминокислотных замен, выбор которых осуществляется именно на основе анализа структуры фермента.

Другим интересным и перспективным ферментом того же класса является ПА из грам-отрицательных бактерий Alcaligenes faecalis. Она является одной из самых термостабильных из всех известных бактериальных ПА, обладает более широким рН-оптимумом активности, который смещен в щелочную область. Также этот фермент имеет некоторые отличия в спектре субстратной специфичности. Из всех известных пенициллинацилаз G он обладает самой высокой специфичностью по отношению к бензилпенициллину, а его специфичность по отношению к амиду D-фенилглицина на порядок выше, чем у фермента из E.coli. Имеются данные, что пенициллинацилаза из A.faecalis обладает более высокими каталитическими характеристиками при кинетическом разрешении рацемических смейсей ряда оптических изомеров. Однако, систематических исследований по изучению механизма действия, структуры, стабильности фермента и его белковой инженерии не проводилось. Кроме того, очень актуальной является проблема создания отечественного штамма — продуцента рекомбинантной ПА из A.faecalis, поскольку все три известные на настоящий момент нуклеотидные и аминокислотные последовательности этого фермента запатентованы. Поэтому еще одной задачей стало клонирование патентно-чистого гена ПА из A.faecalis и изучение свойств рекомбинантного фермента.

2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Заключение диссертации по теме «Биотехнология», Ясная, Анна Сергеевна

5. ВЫВОДЫ

1. Клонирован ген пенициллинацилазы G из E.coli и создан собственный штамм-продуцент рекомбинантного фермента. Проведена оптимизация условий культивирования как для получения фермента дикого типа, так и его мутантных форм.

2. Получены 13 мутантов ПА-G из E.coli и изучены их свойства. Показано, что введенные мутации по-разному влияют на каталитические характеристики фермента в реакциях синтеза антибиотиков и стереоспецифическом синтезе/гидролизе. Получены мутанты с повышенной стереоселективностью в процессах получения оптически-активных соединений и с повышенной эффективностью в реакциях синтеза ампициллина и амоксициллина. В последнем случае параметры а и S/H одновременно улучшены более чем в 6 и 19 раз, соответственно.

3. Клонирован ген пенициллинацилазы G из бактерий Alcaligenes faecalis VKM-B1518 и создан штамм Е. coli -продуцент рекомбинантного фермента. Показано, что нуклеотидная и аминокислотная последовательности клонированной 4/ПА отличаются от таковых из других штаммов A.faecalis, что обеспечивает патентную чистоту полученного фермента. Проведена оптимизация условий культивирования, что позволило повысить выход рекомбинантной 4/ПА в 10 раз.

4. Изучение свойств клонированного фермента показало, что, несмотря на отличия в аминокислотной последовательности, полученный в данной работе фермент близок к ранее исследованным AfYlA как по стабильности, так и по каталитическим свойствам.

5. Изучена термостабильность клонированного фермента при рН 7,5 в диапазоне температур от 49 до 57 °С. Показано, что инактивация полученной AfilA является мономолекулярным процессом. Определены активационные параметры процесса термоденатурации, которые составили ДН#= 555 ±21 кДж/моль, AS#=

2003 ± 64 Дж/(моль*К). Полученные значения характерны для инактивации фермента за счет денатурации белковой глобулы.

6. Проведено компьютерное моделирование и построена трехмерная модель структуры пенициллинацилазы G из A.faecalis. На основании анализа полученной структуры предложены варианты получения пермутированного фермента, состоящего из одной полипептидной цепи.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Ясная, Анна Сергеевна, 2009 год

1. Sakaguchi К, and Murao, S.: A new enzyme, penicillin-amidase. Preliminaries. J Agr Chem Soc Japan 1950, 23(41):l-3.

2. Murao S: Penicillin-amidase. III. Mechanism of penicillin-amidase on sodim penicillin G. J Agr Chem Soc Japan 1955, 29(13):404-407.

3. Batchelor FR, F. P. Doyle, J. H. C. Nayler, and G. N. Rolinson.: Synthesis of penicillin: б-aminopenicillanic acid in penicillin fermentations. Nature 1959,183:257-259.

4. Vanderhaeghe H: Penicillin acylase (fungal). Methods Enzymol 1975, 43:721-728.

5. Shewale JG, Deshpande, B.S., Sudhakaran, V.K., and Ambedkar, S.S. : Penicillin acylases: applications and potentials. Process Biochemlnt 1990, 25:97-103.

6. Shewale JG, Sudhakaran, V.K.: Penicillin V acylase: its potential in the production of 6-aminopenicilIanic acid. Enzyme Microb Technol 1997, 20:402-410.

7. Bruggink A, Roos, E.C., and De Vroom, E.: Penicillin acylase in the industrial production of B-lactam antibiotics. Org Process Res Dev 1998, 2:128-133.

8. Shviadas VK, Klesov AA, Nys PS, Savitskaia EM, Berezin IV: Study of penicillin amidase from E. coli. Kinetics of enzymatic hydrolysis of 7-phenylacetamidodeacetoxycephalosporanic acid. Antibiotiki 1976, 21(8):698-704.

9. Hamilton-Miller JM: Penicillinacylase. Bacteriol Rev 1966, 30(4):761-771.

10. Pundle A, SivaRaman H: Bacillus sphaericus penicillin V acylase: purification, substrate specificity, and active-site characterization. Curr Microbiol 1997, 34(3):144-148.

11. Sudhakaran VK, Shewale JG: Purification and characterization of extracellular penicillin V acylase from Fusarium sp. SKF 235. Hindustan Antibiot Bull 1995, 37(1-4):9-15.

12. Savidge ТА, Cole M: Penicillin acylase (bacterial). Methods Enzymol 1975, 43:705721.

13. Verhaert RM, Riemens AM, van der Laan JM, van Duin J, Quax WJ: Molecular cloning and analysis of the gene encoding the thermostable penicillin G acylase from Alcaligenes faecalis. Appl Environ Microbiol 1997, 63(9):3412-3418.

14. Kim DJ, Byun SM: Purification and properties of ampicillin acylase from Pseuilomonas melanogenum. Biochim Biophys Acta 1990,1040(1):12-18.

15. Claridge CA, Luttinger JR, Lein J: Specificity of Penicillin Amidases. Proc Soc Exp Biol Med 1963,113:1008-1012.

16. Valle F, Balbas P, Merino E, Bolivar F: The role of penicillin amidases in nature and in industry. Trends Biochem Sci 1991,16(l):36-40.

17. Arroyo M, de la Mata I, Acebal C, Castillon MP: Biotechnological applications of penicillin acylases: state-of-the-art. Appl Microbiol Вiotechnol 2003, 60(5):507-514.

18. Rajendhran J, Gunasekaran P: Recent biotechnological interventions for developing improved penicillin G acylases. JBiosci Bioeng 2004, 97(1): 1-13.

19. Polderman-Tijmes JJ: Biochemical characterization of a-amino acid ester hydrolases. Groningen: University of Groningen; 2004.

20. Deshpande BS, Ambedkar, S.S., Sudhakaran, V.K., Shewale, J.G.: Molecular biology of P-lactam acylases. World J Microbiol Biotechnol 1994,10:129-138.

21. Cole M, Savidge T, Vanderhaeghe H: Penicillin acylase (assay). Methods Enzymol 1975,43:698-705.

22. Oliver G, Valle F, Rosetti F, Gomez-Pedrozo M, Santamaria P, Gosset G, Bolivar F: A common precursor for the two subunits of the penicillin acylase from Escherichia coli ATCC11105. Gene 1985, 40(1):9-14.

23. Barbero JL, Buesa JM, Gonzalez de Buitrago G, Mendez E, Pez-Aranda A, Garcia JL: Complete nucleotide sequence of the penicillin acylase gene from Kluyvera citrophila. Gene 1986, 49(l):69-80.

24. Daumy GO, Williams JA, McColl AS, Zuzel TJ, Danley D: Expression and regulation of the penicillin G acylase gene from Proteus rettgeri cloned in Escherichia coli. J Bacteriol 1986,168(1):431-433.

25. Oh SJ, Kim YC, Park YW, Min SY, Kim IS, Kang HS: Complete nucleotide sequence of the penicillin G acylase gene and the flanking regions, and its expression in Escherichia coli. Gene 1987, 56(l):87-97.

26. Ohashi H, Katsuta Y, Hashizume T, Abe SN, Kajiura H, Hattori H, Kamei T, Yano M: Molecular cloning of the penicillin G acylase gene from Arthrobacter viscosus. Appl Environ Microbiol 1988, 54(ll):2603-2607.

27. Schumacher G, Sizmann D, Haug H, Buckel P, Bock A: Penicillin acylase from E. coli: unique gene-protein relation. Nucleic Acids Res 1986,14(14):5713-5727.

28. Duggleby HJ, Tolley SP, Hill CP, Dodson EJ, Dodson G, Moody PC: Penicillin acylase has a siugle-amino-acid catalytic centre. Nature 1995, 373(65ll):264-268.

29. Kasche V, Lummer K, Nurk A, Piotraschke E, Rieks A, Stoeva S, Voelter W: Intramolecular autoproteolysis initiates the maturation of penicillin amidase from Escherichia coli. Biochim Biophys Acta 1999,1433(l-2):76-86.

30. Lindsay CD, Pain RH: The folding and solution conformation of penicillin G acylase. Eur J Biochem 1990,192(1):133-141.

31. Economou A: Bacterial protein translocase: a unique molecular machine with an army of substrates. FEBSLett 2000, 476(1-2):18-21.

32. Chou CP, Tseng JH, Kuo BY, Lai KM, Lin MI, Lin HK: Effect of SecB chaperone on production of periplasmic penicillin acylase in Escherichia coli. Biotechnol Prog 1999,15(3):439-445.

33. Berks ВС: A common export pathway for proteins binding complex redox cofactors?

34. MolMicrobiol 1996, 22(3):393-404.

35. Ignatova Z, Hornle C, Nurk A, Kasche V: Unusual signal peptide directs penicillin amidase from Escherichia coli to the Tat translocation machinery. Biochem Biophys Res Commim 2002, 291(1):146-149.

36. Chou CP, Yu CC, Tseng JH, Lin MI, Lin HK: Genetic manipulation to identify limiting steps and develop strategies for high-level expression of penicillin acylase in Escherichia coli. Biotechnol Bioeng 1999, 63(3):263-272.

37. Chou CP, Tseng JH, Lin MI, Lin HK, Yu CC: Manipulation of carbon assimilation with respect to expression of the рас gene for improving production of penicillin acylase in Escherichia coli. J Biotechnol 1999, 69(l):27-38.

38. Kasche V, Haufler U, Markowsky D, Melnyk S, Zcich A, Galunsky B: Penicillin amidase fromii. coli. Enzyme heterogeneity and stability. Ann NY Acad Sci 1987, 501:97-102.

39. Ignatova Z, S. Stoeva, B. Galunsky, C. Hornle, A. Nurk, E. Piotraschke, W. Voelter and V. Kasche Proteolytic processing of penicillin amidase from Alcaligenes faecalis cloned in E. coli yields several active forms. Biotechnol Lett 1998, 20(10):977-982.

40. Margolin AL, Svedas VK, Berezin IV: Substrate specificity of penicillin amidase from E. coli. Biochim Biophys Acta 1980, 616(2):283-289.

41. Niersbach H, Kuhne A, Tischer W, Weber M, Wedekind F, Plapp R: Improvement of the catalytic properties of penicillin G acylase from Escherichia coli ATCC 11105 by selection of a new substrate specificity. Appl Microbiol Biotechnol 1995, 43(4):679-684.

42. Galunsky B, Lummer K., Kasche V.: Comparative study of substrate- and stereospecificity of penicillin G amidases from different sources and hybrid isoenzymes. Monat fur Chemie 2000,131:623-632.

43. Oinonen C, Rouvinen J: Structural comparison of Ntn-hydrolases. Protein Sci 2000, 9(12):2329-2337.

44. Швядас BK, Марголин A.JI., Шерстюк С.Ф., Березин И.В.: Инактивация растворимой и иммобилизованной пенициллинамидазы из E.coli под действием фенилметилсульфонилфторида: кинетический анализ и титрование активных центров. БиооргХимия 1977, 3:546-554.

45. Brannigan JA, Dodson G, Duggleby HJ, Moody PC, Smith JL, Tomchick DR, Murzin AG: A protein catalytic framework with an N-terminal nucleophile is capable of self-activation. Nature 1995, 378(6555):416-419.

46. Alkema WB, Hensgens CM, Snijder HJ, Keizer E, Dijkstra BW, Janssen DB: Structural and kinetic studies on ligand binding in wild-type and active-site mutants of penicillin acylase. Protein EngDes Sel 2004,17(5):473-480.

47. Alkema WB, Prins AK, dc Vries E, Janssen DB: Role of alphaArgl45 and betaArg263 in the active site of penicillin acylase of Escherichia coli. Biochem J 2002, 365(Pt l):303-309. i

48. McVey СЕ, Walsh MA, Dodson GG, Wilson KS, Brannigan JA: Crystal structures of penicillin acylase enzyme-substrate complexes: structural insights into the catalytic mechanism. JMol Biol 2001, 313(1):139-150.

49. Done SH, Brannigan JA, Moody PC, Hubbard RE: Ligand-induced conformational change in penicillin acylase. JMol Biol 1998, 284(2):463-475.

50. Janssen MHA, Sheldon, R.A.: Properties of Immobilised Penicillin G Acylase in p-Lactam Antibiotic Synthesis. Delft: Delft University; 2006.

51. Svedas V, Guranda D, van Langen L, van Rantwijk F, Sheldon R: Kinetic study of penicillin acylase from Alcaligenes faecalis. FEB S Lett 1997, 417(3):414-418.

52. Dineva MA, Gatunsky В., Kasche V., Petkov D.D.: Phenylacetyl group as enzyme-cleavable aminoprotection of purine nucleosides. Bioorg Med Chem Lett 1993, 3:2781-2784.

53. Piotraschke E. NA, Galunsky В., Kasche V.: Genetic construction of catalytically active cross-species heterodimer penicillin G amidase. Biotechnol Lett 1994,16:119124.

54. Gabor EM, de Vries E.J., Janssen D.B.: A novel penicillin acylase from the environmental gene pool with improved synthetic properties. Enzyme Microb Technol 2005, 36:182-190.

55. Kasche V, Galunsky B, Ignatova Z: Fragments of pro-peptide activate mature penicillin amidase of Alcaligenesfaecalis. EurJBiochem 2003, 270(23):4721-4728.

56. Kumar RS, Suresh CG, Pundle A, Prabhune A: Evidence for the involvement of arginyl residue at the active site of penicillin G acylase from Kluyvera ciirophila. Biotechnol Lett 2004, 26(20): 1601 -1606.

57. Piotraschke E, Nurk A., Galunsky В., Kasche V.: Genetic construction of catalytically active cross-species heterodimer penicillin G amidase. Biotechnol Lett 1994,16:119124.

58. Kumar RS, Prabhune A.A., Pundle A.V., Karthikeyan M., Suresh C.G.: A tryptophan residue is identified in the substrate binding of penicillin G acylase from Kluyvera с it гор hi la. Enzyme Microb Technol 2007, 40:1389-1397.

59. Chiang C, Bennett RE: Purification and properties of penicillin amidase from Bacillus megaterium. JBacteriol 1967, 93(l):302-308.

60. Kang JH, Hwang Y, Yoo OJ: Expression of penicillin G acylase gene from Bacillus megaterium ATCC 14945 in Escherichia coli and Bacillus subtilis. J Biotechnol 1991, 17(2):99-108.

61. Zhang LF, Li ZW, Zhang QJ: Cloning and expression of penicillin G acylase gene in Bacillus megaterium. Chin J Biotechnol 1991, 7(l):63-72.

62. Martin L, Prieto MA, Cortes E, Garcia JL: Cloning and sequencing of the рас gene encoding the penicillin G acylase of Bacillus megaterium ATCC 14945. FEMS Microbiol Lett 1995,125(2-3):287-292.

63. Kang HK, Park JY, Ahn JS, Kim SH, Kim D: Cloning of a gene encoding dextranase from Lipomyces starkeyi and its expression in Pichia pastoris. J Microbiol Biotechnol 2009,19(2):172-177.

64. Lu Y, Chi X, Yang Q, Li Z, Liu S, Gan Q, Qin S: Molecular cloning and stress-dependent expression of a gene encoding Delta(12)-fatty acid desaturase in the Antarctic microalga Chlorella vulgaris NJ-7. Extremophiles 2009.

65. Lu Y, Zhao H, Zhang C, Lai Q, Wu X, Xing XH: Expression of NAD+-dependent formate dehydrogenase in Enterobacter aerogenes and its involvement in anaerobic metabolism and H2 production. Biotechnol Lett 2009, 31(10):1525-1530.

66. Karimi M, De Meyer B, Hilson P: Modular cloning in plant cells. Trends Plant Sci 2005,10(3):103-105.

67. Karimi M, Depicker A, Hilson P: Recombinational cloning with plant gateway vectors. Plant Physiol 2007,145(4): 1144-1154.

68. Cao Y, Lu Z, Sun P, Sun J, Liu Z: Cloning and expression of 3C protease gene from foot-and-mouth disease virus in insect cell. Wei Sheng Wu Xue Bao 2008, 48(3):312-316.

69. Khodabandehloo M, Shamsi Shahrabadi M, Keyvani H, Bambai B: Cloning and expression of simian rotavirus spike protein (VP4) in insect cells by baculovirus expression system. Iran BiomedJ2009,13(1):9-18.

70. Liu Z, Yang G, Li B, Chi C, Wu X: Cloning, co-expression with an amidating enzyme, and activity of the scorpion toxin BmK ITal cDNA in insect cells. Mol Biotechnol 2003, 24(l):21-26.

71. Liu Z, Yang GZ, Chi CW, Wu XF: Cloning and high-level expression of scorpion toxin BmKITal in Escherichia coli and insect cells. Protein Pept Lett 2002, 9(5):419-426.

72. Farrokhi N, Hrmova M, Burton RA, Fincher GB: Heterologous and cell free protein expression systems. Methods Mol Biol 2009, 513:175-198.

73. Schvvarz D, Dotsch V, Bernhard F: Production of membrane proteins using cell-free expression systems. Proteomics 2008, 8(19):3933-3946.81.