Изучение условий раздельного и совместного культивирования молочнокислых, пропионовокислых бактерий и гриба Lentinus tigrinus штамм ВКМ F-3616D на послеспиртовой барде тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.23, кандидат биологических наук Фадеева, Ирина Васильевна

• Фадеева, Ирина Васильевна
• кандидат биологических наук
• 2009

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Фадеева, Ирина Васильевна

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Физико-химические свойства, биохимический состав и кормовая цен- 9 ность послеспиртовой барды

1.2 Технологии переработки послеспиртовой барды

1.3 Общая характеристика микроорганизмов, обладающих пробиотиче- 24 скими свойствами

1.3.1 Бифидобактерии

1.3.2 Лактобактерии

1.3.3 Пропионовокислые бактерии

1.4 Общая характеристика базидиомицетов, используемых для получе- 39 ния кормового белка

1.5 Общая характеристика пробиотических препаратов

1.6 Влияние условий культивирования на рост молочнокислых, пропио- 56 новокислых бактерий и грибных культур

ГЛАВА 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1 Объекты исследования

2.2 Культивирование исследуемых микроорганизмов

2.3 Определение количества живых клеток в препаратах барды, обрабо- 72 танных молочнокислыми и пропионовокислыми бактериями

2.4 Определение концентрации белка

2.5 Определение концентрации нуклеиновых кислот

2.6 Определение редуцирующих Сахаров

2.7 Статистическая обработка результатов

ГЛАВА 3 ИЗУЧЕНИЕ ПРОЦЕССОВ РАЗДЕЛЬНОГО И СОВМЕСТНО- 77 ГО ПЕРИОДИЧЕСКОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МОЛОЧНОКИСЛЫХ

И ПРОПИОНОВОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ НА ФИЛЬТРАТЕ ПОСЛЕСПИРТОВОЙ БАРДЫ

3.1 Оптимизация состава среды на основе барды для культивирования 77 молочнокислых, бифидо- и пропионовокислых бактерий

3.1.1 Влияние СаСОз на рост бактерий на фильтрате послеспиртовой 77 барды

3.1.1.1 Влияние СаСОз на рост лактобацилл на фильтрате послеспирто- 78 вой барды

3.1.1.2 Влияние СаСОз на рост бифидобактерий на фильтрате послеспир- 81 товой барды

3.1.1.3 Влияние концентраций СаСОз на совместный рост лактобактерий 84 и бифидобактерий на фильтрате послеспиртовой барды

3.1.2 Определение оптимума рН для культивирования на послеспиртовой 86 барде лактобацилл и бифидобактерий

3.1.3 Определение оптимума температуры при совместном культивиро- 89 > вания на послеспиртовой барде лактобацилл и бифидобактерий

3.1.4 Изучение влияния температуры хранения полученных препаратов 89 барды на их качественные и количественные показатели

3.2 Изучение роста и развития молочнокислых и пропионовокислых бак- 93 терий при последовательном культивировании на послеспиртовой барде

3.2.1 Влияние хлорида кобальта на рост пропионовокислых бактерий на 93 фильтрате послеспиртовой барды

3.2.2 Изучение роста и развития молочнокислых и пропионовокислых 97 бактерий при последовательном культивировании на фильтрате послеспиртовой барды

3.2.3 Хранение препаратов, полученных на основе молочнокислых и про- 100 пионовокислых бактерий

ГЛАВА 4 ИЗУЧЕНИЕ ПРОЦЕССОВ ПОЛУНЕПРЕРЫВНОГО РАЗ- 107 ДЕЛЬНОГО И СОВМЕСТНОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МОЛОЧНОКИСЛЫХ И ПРОПИОНОВОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ 4.1 Подбор концентрации и соотношения инокулята лактобактерий и 108 бифидобактерий в условиях периодического статического культивирования

4.2 Сравнительная характеристика статического и динамического перио- 115 дического культивирования молочнокислых и пропионовокислых бактерий на барде

4.3 Полунепрерывное культивирование молочнокислых и пропионово- 119 кислых бактерий на барде

ГЛАВА 5. ИЗУЧЕНИЕ ПРОЦЕССОВ СОВМЕСТНОГО КУЛЬ

ТИВИРОВАНИЯ МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ И ГРИБОВ LENTINUS TIGRINUS ВКМ F-3616D

5.1 Изучение процессов совместного культивирования молочнокислых 127 бактерий и грибов на нативной послеспиртовой барде

5.2 Изучение процессов совместного культивирования молочнокислых 136 бактерий и грибов на твердом осадке послеспиртовой барды

ВЫВОДЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Изучение условий раздельного и совместного культивирования молочнокислых, пропионовокислых бактерий и гриба Lentinus tigrinus штамм ВКМ F-3616D на послеспиртовой барде»

Актуальность темы

В последние годы мировая индустрия производства спиртов растет огромными темпами [Pimentel D. et al., 2007; Кухаренко A.A., Дадашев М.Н., 2004], в связи с чем ежегодно образуются миллионы тонн различных органических отходов и побочных продуктов, среди которых самую большую долю занимает послеспиртовая барда (около 12 кг на 1 л произведенного спирта). В России около 10-15% от ее общего количества применяется в осенне-зимний период в натуральном виде для откорма скота и около 20% перерабатывается в кормовые препараты для животноводства. Однако большая часть барды, особенно в летний период портится, т.к. из-за высокого влагосодержания не подлежит длительному хранению (не более 1-2 суток) [Кухаренко A.A., Вина-ров А.Ю., 2001; Сорокодумов С.Н. и др., 2005]. В этой связи на спиртзаводах достаточно часто происходит ее бесконтрольный сброс в окружающую среду. Принимая во внимание, что в послеспиртовой барде содержится значительное количество питательных веществ (сырой протеин, липиды, органические кислоты, макро- и микроэлементы), она является биологически нестабильной средой, в которой интенсивно развиваются процессы закисания и гниения. Поэтому сброс послеспиртовой барды без предварительной очистки представляет серьезную экологическую опасность для почвы и водоемов.

Проблема утилизации послеспиртовой барды актуальна практически для всех стран, в т.ч. России, т.к. запрещается сбрасывать барду в водоёмы или в канализацию без предварительной переработки [п.5 ст.8 Федерального закона №171-ФЗ от 22.11.1995]. К настоящему времени в мире барду тем или иным образом перерабатывают, в основном на корма [Kim Y. et al., 2008; Римарева JI.B. и др., 2006] по достаточно энергозатратной технологии, основанной на сочетании процессов центрифугирования, вакуум-выпаривания и сушки. В результате получается сухая барда, выпускаемая за рубежом в виде нескольких продуктов - dried distillers grains (DDG), dried distillers grains and soluble

DDGS), wet wheat distillers' grains (WWDG). Многочисленные исследования показали, что кормовая ценность этих продуктов сопоставима с традиционными кормами [Ham G.A. et al., 1994; Klopfenstein T.J. et al., 2008]. В России полный цикл переработки барды в «DDGS», реализован только на некоторых заводах.

Существует и ряд технологий микробиологической и биохимической биоконверсии барды, путем культивирования на ней дрожжей, молочнокислых бактерий или ассоциаций микроорганизмов с добавлением грубых кормов и ферментов [Клиндюк A.M. и др., 2004; Olstorpe М. et al., 2008; Курзин А.Б., 2005; Vogel R.F. et al., 1999]. Молочнокислые бактерии к тому же обладают антагонистическим действием по отношению к патогенной микрофлоре желудочно-кишечного тракта, от которой ежегодно происходит гибель значительной доли молодняка сельскохозяйственных животных[Ьауегпнсосса Р. et al., 2000]. Кроме того, добавление этих бактерий может способствовать консервированию барды (за счет накопления органических кислот и специфических антибиотиков) и продлить срок ее хранения, а соответственно и срок реализации без дополнительной энергозатратной сушки. Недостатком молочнокислого заквашивания барды является относительно низкое накопление белка, что может быть компенсировано введением грибных культур, например, базиди-альных, характеризующихся высоким (до 56% от сухих веществ) содержанием белка и высокой гидролитической активностью [Решетникова И.А., 1997]. Одновременное выращивание с вышеуказанными бактериями грибов-базидиомицетов, позволяет гидролизовать лигноцеллюлозные комплексы, а также дополнительно обогатить субстрат сахарами, витаминами, белковой массой и ферментами.

Цель и задачи исследования

Цель работы:

Изучение условий раздельного и совместного культивирования молочнокислых и пропионовокислых бактерий и гриба Lentinns tigrinas штамм ВКМ F-3616D.

Для выполнения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Изучить влияние условий раздельного культивирования на послес-пиртовой барде и/или ее компонентах на рост пропионовокислых и молочнокислых бактерий, а также гриба ЬепИпиз И^гтш ВКМГ-3616В;

2. Изучить влияние соотношения инокулятов изучаемых микроорганизмов при совместном культивировании на рост, накопление белка и редуцирующих веществ и биологическую стойкость получаемого продукта;

3. Изучить процессы совместного культивирования на послеспиртовой барде и/или ее компонентах пропионовокислых и молочнокислых бактерий, а также гриба ЬепИпш й^гтш ВКМ¥-3616В и молочнокислых бактерий.

Научная новизна

Впервые изучены возможность совместного культивирования базиди-ального гриба Ьепйпт Н^тиБ В КМ Е-361бО и молочнокислых бактерий на нативной барде и ее обезвоженном компоненте, подобраны оптимальные соотношения этих культур, обеспечивающие наибольшее накопление биомассы, белка, редуцирующих веществ. Исследована биологическая стойкость полученных препаратов. Также изучены процессы раздельного и совместного полунепрерывного культивирования молочнокислых и пропионовокислых бактерий, обладающих пробиотической активностью на нативной послеспиртовой барде.

Научно-практическая значимость работы

На основании проведенных исследований, разработана и внедряется на ОАО «Мордовспирт» технология производства биопрепаратов на основе послеспиртовой барды и микроорганизмов, обладающих пробиотическими свойствами.

Апробация работы

Основные результаты работы были представлены для обсуждения на научных конференциях профессорско-преподавательского состава и аспирантов ГОУВПО «Мордовский государственный университет им. Н.П.Огарева»,

Пятом съезде Общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова (Москва, 2008 г.), XXXVI Огаревских чтениях в Мордовском государственном университете имени Н.П. Огарева (Саранск, 2008), VIII республиканской научно-практической конференции «Наука и инновации в Республике Мордовия» (Саранск, 2009 г).

Заключение диссертации по теме «Биотехнология», Фадеева, Ирина Васильевна

выводы

1. Совместное культивирование лактобацилл и бифидобактерий на по-слеспиртовой барде показало, что максимальное накопление биомассы, белка и числа клеток происходит при начальном значении рН равном 6,5 и температуре - 35-37°С. Раздельное культивирование этих микроорганизмов приводит к существенно меньшему накоплению биомассы и белка.

2. Установлено, что при выращивании бактерий на послеспиртовой барде инокулят пропионовокислых бактерий целесообразно вносить после 3-х часов предварительной инкубации лактобацилл.

3. Содержание нуклеиновых кислот в препаратах, полученных как с помощью раздельного, так и с помощью совместного культивирования бактерий не превышает допустимой для животных нормы потребления.

4. Показано, что при хранении полученных препаратов при температуре 4°С свойства и максимальное количество живых клеток бактерий сохранялось до 28-30 суток.

5. Полунепрерывное совместное культивирование бифидо-, молочнокислых и пропионовокислых бактерий позволяет получить выход биомассы живых клеток до 7,4 г/л.

6. Совместное культивирование на барде грибов ЬепНпш й^гтт ВКМР-3616Б и молочнокислых бактерий приводит к более интенсивному росту культур и обогащению субстрата белком. Оптимальным вариантом для культивирования на нативной барде является - внесение 0,2% (по сухому весу) грибного инокулята и

2*10 КОЕ/л молочнокислых бактерий. Для твердого осадка барды оптимальным является внесение 2% (по сухому весу) грибного и о

5*10 КОЕ/кг твердого осадка бактериального инокулята.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Фадеева, Ирина Васильевна, 2009 год

1. Hugenholtz, J. Nutraceutical production by Propionibacteria / J. Hugenholtz, J. Hunik, H. Santos, E. Smid // Lait. 2002. - V. 82. - P. 103-112.

2. Van Luijk, N., M. P. Stierli, S. M. Schweninger, C. Herve, G. Dasen, J. P. M. Jore, P. H. Pouwels, M. J. van der Werf, M. Teuber, and L. Meile. 2002. Genetics and molecular biology of Propionibacteria.

3. Abadulla ,E. Decolorization and detoxification of textile dyes with a laccase from Tramies hirsuta /E. Abadulla, T. Tzanov, S. Costa, K.H. Robra, P.A. Cavaco, G.M. Guebitz //Appl.Environ.Microbiol.-2000.-V.66.-P.3357-3362.

4. Akayezu, J. Use of distillers grains and co-products examined / J. Akayezu, J. Linn, S. Harty, J. Cassady // Feedstuffs. 1998. - №12 - P. 11-13.

5. Akazama, H. Production of a mixture of antimicrobial organic acids from lactose by coculture of Bifidobacterium longum and Propionibacterium freudenreichii / H. Akazama, O. Takeda // Biosci. Biotechnol. Biochem. 1998. -V.62.-P. 121-127.

6. Anand, S. K. Antibacterial activity associated with Bifidobacterium bifidum / S.K. Anand, R. A. Srinivasan, L. K. Rao // Cult. Dairy Prod. J. 1985. -V.20.-P. 21-23.

7. Annuk, H. Characterization of intestinal lactobacilli as putative probiotic candidates / H. Annuk, J. Shchepetova, T. Kullisaar, E. Songisepp, M. Zilmer, M. Mikelsaar // J. Appl. Microbiol. 2003. - V. 94. - P. 403-412.

8. Arena, M. Biogenic amine production by Lactobacillus / M. Arena, M. Manca de Nadra //J. Appl. Micribiol. 2001. - V90. - P. 158-162.

9. Bradford, M.M. A rapid and sensitive method for the quantization of microgram quantities of protein utilizing the principal of protein-bye binding / M.M. Bradford //Anal. Biochem. 1976. - Vol. 72. - P. 248 - 254.

10. Bressler. D.C. Oxidation carbazole, iV-ethylcarbazole, fluorine, and dibenzothiophene by the laccase of Coriolopsis gallica / Bressler D.C., Fedorak P.M., Pickard M.A.//Biotech.Lett.-2000.-V.22.-P.l 119-1125.

11. Carneiro, A. Polyoxometalates as promoters of laccase-assisted reaction / A. Carneiro, A. Abreu, D.V. Evtuguin, S.P. Neto, G. Guebitz, A.C. Paulo // J. Mol. Catal. B Enzym.-2000.-V.9.-P.293-295.

12. Cheng, R. Growth characteristics of bifidobacteria species in whey base medium / R. Cheng, W. E. Sandine // J. Dairy Sci. 1989. - V. 72. - P. 148

13. Cibik, R. Characterization of autolytic enzymes in Lactobacillus pentosus / R. Cibik, M.P. Chapot-Chartier // Letters in applied microbiology. -2004. Vol. 38, № 6. - P/ 459-463.

14. De Vuyst, L Heteropolysaccharides from lactic acid bacteria / L. De Vuyst, B. Degeest // FEMS Microbiol. Rev. 1999. - V.23, №2 - P. 153-177.

15. Deguchi, T. Nylon biodégradation by lignin-degrading fungi / T. Deguchi // Appl. Environ. Microbiol. 1997. -V.63.-P. 329-331.

16. Faye, T. An antimicrobial peptide is produced by extracellular processing of a protein from Propionibacterium jensenii / T. Faye, D. A. Brede, T. Langsrud, I. F. Nés, H. Holo. // J. Bacteriol. 2002. - V. 184. - P. 3649-3656

17. Feng, X. Propionic acid fermentation by Propionibacterium freudenreichii CCTCC M207015 with a fibrous-bed bioreactor / X. Feng, B. Wu, X. Shen, H. Xu // Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao. 2008a. - V. 24, №6. - P. 1075-1079.

18. Feng, X., Kinetic analysis and pH-Shifït control strategy for propionic acid production with Propionibacterium freudenreichii CCTCC M207015 / X. Feng , H. Xu , J. Yao , S. Li, H. Zhu , P. Ouyang // Appl Biochem Biotechnol. 2008b. -V. 15.-P. 121-132

19. Fukuda, T. Degradation of bisphenol A by purified laccase from Trametesvillosa / T. Fukuda, H. Uchida, Y. acashima, T. Uwajima, T. Kawabata, M. Suzuki // Biochem.Biophys.Res.Commun. 2001. - V.284. - P.704-706.

20. Fuller, R. Probiotics in man and animals. A review. / R. Fuller // J. Appl. Bacteriol. 1989. - V. 66. - P. 365-378.

21. Gill, D. R. The effect of probiotic feeding on health and performance ofnewly-arrived stocker calves / D. R. Gill, R. A. Smith, and R. L. Ball. // Okla. Agrie, Exp. Stn. 1987. - MP-119. - P. 202-204.

22. Gutiérrez A., del Rio J.C., Martinez M.J., Martinez A.T. Fungal degradation of lipophilic extractives in Eucalyptus globulus wood / A. Gutiérrez, J.C. del Rio, M.J. Martinez, A.T. Martinez // Appl.Environ. Microbiol. 1999. -V.65. - №4.-P. 1367-1371.

23. Hammel, K.E. Fungal degradation of lignin / Hammel K.E. In Cadisch G., Giller K.E. eds.Chap.2. Driven by nature: plant litter quality and decomposition.-United Kingdom: CAB International, 1997. P. 33-45.

24. Hosono, A. Characterization of a water-soluble polysacharide fraction with immunopotentiating activity from Bifidum adolescens M-101-4 / A. Hosono, J. Lee, A. Ametani, M. Hatsume, M. Hirayama //Bisc. Biotech. Biochem. 1997. -V.61. — P.312-316.

25. Ibrahim, S. A. Inhibition of Escherichia coli by bifidobacteria / S. A. Ibrahim, A. Bezkorovainy // J. Food Prot. 1993. - V. 56. - P. 713-715.

26. Klein, G. Taxonomy and physiology of probiotic lactic acid bacteria / G. Klein, A. Pack, C. Bonaparte, G. Reuter// Int. J. Food Microbiol. 1998. - № 41. -P. 103-125.

27. Klopfenstein, T. J. G Use of distillers by-products in the beef cattle feeding industry / T.J. Klopfenstein, G.E. Erickson, V.R. Bremer // J. Anim Sci. -2008. -V. 86. P. 1223-1231.

28. Krehbiel, C. R. Gilliland. 2003. Bacterial direct-fed microbials in ruminant diets: Performance response and mode of action. / C. R. Krehbiel, S. R. Rust, G. Zhang, and S. E. Gilliland // J. Anim. Sci. 2003. - V. 81. - P. 120132.

29. Lee, Y. Enhancement in ex vivo phagocytic capacity of peritoneal leukocytes in mice by oral delivery of various lactic-acid-producing bacteria / Y. Lee, T.S. Lee // Curr. Microbiol. 2005. - V. 50, № 1. - P. 24-27.

30. Mougin, С. Cleavage of the diketonitrile derivative herbicide isoxaflutole by extracellular fungal oxidases / Mougin C., Boyer F.D., Caminade E., Rama R. // J. Agric. Food Chem.-2000.-V.48.-P.4529-4534.

31. Mustafa, A. Chemical characterization and in vitro crude protein degradability of thin stilläge derived from barley- and wheat-based ethanol production / A. Mustafa, J. McKinnon, D. Christensen // Anim. Feed Sei. Technol. 1999.-V. 80.-P. 247-256.

32. Ojowi, M. Evaluation of weat-based wet distillers grains for feedlot cattle / M. Ojowi, D. Christensen, A. Mustafa, J. McKinnon // Can. J. Anim. Sei. -1997.-V. 77.-P. 447-454.

33. Parvez, S. Probiotics and their fermented food products are beneficial for health / S. Parvez, K.A. Malik, S. Ah Kang, H.Y. Kim // J. Appl. Microbiol. -2006. V. 100, № 6. - P. 1171-1185.

34. Pimentel, D. Ethanol production: energy, economic, and environmental losses / D. Pimentel, T. Patzek, G. Cecil // Rev Environ Contam Toxicol. 2007.-V.189. - P. 25-41.

35. Poypard, J.A. Biology of the bifidobacteria / J.A. Poypard, I. Husain, R. Norris //Bacterid. Rev. 1973. - V.37. -N32. -P.136-165.

36. Raghukumar, C. Lignin-modifying enzymes of Flavodon flavus, a basidiomycete isolated from a coastal marine environment / C. Raghukumar, T.M. D'Souza, R.G. Thorn, C.A. Reddy // Appl. Environ. Microbiol.- 1999.- V. 65.- № 5.- P. 2103-2111.

37. Soares, J.M.B. Decolorization of an anthraquinone-type dye using a laccase formulation / J.M.B. Soares, F.M. Costa, M.T.P. De Amorium //Bioresour.Technol.-2001 .-V.79.-P. 171-177.

38. Spichs M., Whitney M:, Shurson G. Nutrient database for distiller,s dried grains with solubles produced from ethanol plants in Minnesota and South Dakota / M. Spichs, M. Whitney, G. Shurson // J. Anim. Sci. 2002. - V. 80, № 10. -P. 2639-2645.

39. Tsutsumi, Y. Removal of estrogenic activités of bisphenol A and nonylphenol by oxidative enzymes from lignin-degrading basidiomycetes / Y.Tsutsumi, T.Haneda, T.Nishida //Chemosphere.-2001.-V.42.-P.271-276.

40. Vogel, R.F. Non-dairy lactic fermentations: the cereal world / R.F. Vogel, R. Knorr, M.R. Müller, U. Steudel, M.G. Gänzle, M.A. Ehrmann // Antonie

41. Van Leeuwenhoek. -1999. V. 76. -P.403-411.

42. Vorobjeva, L.I. Antimutagenicity of propionic acid bacteria / Vorobjeva L.I. et al. // Mutat.Res. 199К V.251, № 6. - P.233-239.

43. Wu, Y. Fractionation and characterization of protein rich material from barley after alcohol distillation / Wu Y. // Cereal. Chem. - 1986. - V. 63. - P. 142-144.

44. Алешкин, В.А. Микробиология на службе здорового питания /

45. B.А. Алешкин, И.М. Жакевич //Молочная промышленность. 1999. - №11.1. C.14.

46. Алимов, Т.Д. Получение силоса высокого качества / T.JI. Алимов //Зоотехния. 1992. - №9-10. С16-19.

47. Антипов, С.Т. Послеспиртовая зерновая барда. Технология переработки / С.Т. Антипов, A.B. Журавлев // Производство спирта и ликерово-дочных изделий. 2005. - №4. - С.9-11.шпох&ние- I1. УТВЕРЖДАЮ1. Генеральный директор1. АКТ ИСПЫТАНИЯ

48. На основании проведенных исследований получен продукт с пробиотическими свойствами:- содержание живых клеток бактерий 106 КОЕ/мл;- выход биомассы — 7,8 г/л;- оптимальный период хранения при 8 °С 19 суток.

49. Главный технолог ОАО «Мордовспирт»1. Н.А. Кручинина

50. Технический директор ОАО «Мордовспирт»1. В.Н. Хрущалин